Advanced search in Research products
Research products
arrow_drop_down
Searching FieldsTerms
Any field
arrow_drop_down
includes
arrow_drop_down
The following results are related to Energy Research. Are you interested to view more results? Visit OpenAIRE - Explore.
28,168 Research products
Relevance
arrow_drop_down
unfold_lessCompact results

  • Energy Research
  • Open Access
  • medical and health sciences
  • US
  • AU

  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: S. Nithyapriya; Sundaram Lalitha; R. Z. Sayyed; M. S. Reddy; +4 Authors

    Siderophores are low molecular weight secondary metabolites produced by microorganisms under low iron stress as a specific iron chelator. In the present study, a rhizospheric bacterium was isolated from the rhizosphere of sesame plants from Salem district, Tamil Nadu, India and later identified as Bacillus subtilis LSBS2. It exhibited multiple plant-growth-promoting (PGP) traits such as hydrogen cyanide (HCN), ammonia, and indole acetic acid (IAA), and solubilized phosphate. The chrome azurol sulphonate (CAS) agar plate assay was used to screen the siderophore production of LSBS2 and quantitatively the isolate produced 296 mg/L of siderophores in succinic acid medium. Further characterization of the siderophore revealed that the isolate produced catecholate siderophore bacillibactin. A pot culture experiment was used to explore the effect of LSBS2 and its siderophore in promoting iron absorption and plant growth of Sesamum indicum L. Data from the present study revealed that the multifarious Bacillus sp. LSBS2 could be exploited as a potential bioinoculant for growth and yield improvement in S. indicum.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Sustainabilityarrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Sustainability
    Article . 2021 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Sustainability
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Sustainability
    Article . 2021
    Data sources: DOAJ
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    110
    citations110
    popularityTop 1%
    influenceTop 10%
    impulseTop 1%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Sustainabilityarrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Sustainability
      Article . 2021 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Sustainability
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Sustainability
      Article . 2021
      Data sources: DOAJ
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Stewart, Arthur D.; Gardiner, Matthew; MacDonald, Jonathan; Williams, Hector;

    Building, bridge or wind turbine maintenance requires manual dexterity tasks by a specialist rope-access trained workforce via two principal means: harness suspension of individual workers from above, or deployment of a suspended platform or cradle from which workers access the structure to be maintained. Currently no published research compares accuracy and efficiency of simulated maintenance tasks between these modalities. This study investigated manual dexterity task performance of peg placement and shape delineation in seated, standing and suspended environments in 16 healthy controls and 26 professional rope-access trained individuals. Both seated and standing assessments were superior to those suspended, and height of suspension, total mass and years of experience had no influence on the task outcome. These findings suggest that, where feasible, cradle suspension mechanisms which permit standing maintenance are favourable in terms of task efficacy and where feasible, should be considered for deployment in wind energy and other engineering applications.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ OpenAIR@RGU (Robert ...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Applied Ergonomics
    Article
    License: CC BY NC ND
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
    Applied Ergonomics
    Article . 2021 . Peer-reviewed
    License: Elsevier TDM
    Data sources: Crossref
    3
    citations3
    popularityTop 10%
    influenceAverage
    impulseAverage
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ OpenAIR@RGU (Robert ...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Applied Ergonomics
      Article
      License: CC BY NC ND
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
      Applied Ergonomics
      Article . 2021 . Peer-reviewed
      License: Elsevier TDM
      Data sources: Crossref
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Pulmonary Division, Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, and Veterans Administration Medical Center, Gainesville, Florida, USA ( host institution ); Block, A.Jay ( author ); Hellard, Donald W. ( author ); Slayton, Paul C. ( author );

    Breathing and oxygenation were monitored in 78 asymptomatic volunteers on two successive nights of sleep. Four groups of subjects were recruited: 20 young men, 20 young women, 20 men older than 40 years, and 18 postmenopausal women. In random order, subjects ingested either 2 ml/kg (body weight) of 100-proof vodka in orange juice or a similar amount of water in orange juice before bedtime. Alcohol ingestion shortened sleep in the older men and in the postmenopausal women. No effect of alcohol ingestion on breathing or oxygenation during sleep was seen in any group of women. In men, alcohol ingestion increased the numbers of desaturation episodes and caused more severe oxygen desaturation during sleep. The effect of alcohol ingestion on breathing and oxygenation during the sleep of asymptomatic volunteers appears to be limited to men.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ University of Florid...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
    The American Journal of Medicine
    Article . 1986 . Peer-reviewed
    License: Elsevier TDM
    Data sources: Crossref
    48
    citations48
    popularityAverage
    influenceTop 10%
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ University of Florid...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
      The American Journal of Medicine
      Article . 1986 . Peer-reviewed
      License: Elsevier TDM
      Data sources: Crossref
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Frédéric Chevallier; Pierre Regnier; Julia Pongratz; Atul K. Jain; +30 Authors

    Abstract. Regional land carbon budgets provide insights on the spatial distribution of the land uptake of atmospheric carbon dioxide, and can be used to evaluate carbon cycle models and to define baselines for land-based additional mitigation efforts. The scientific community has been involved in providing observation-based estimates of regional carbon budgets either by downscaling atmospheric CO2 observations into surface fluxes with atmospheric inversions, by using inventories of carbon stock changes in terrestrial ecosystems, by upscaling local field observations such as flux towers with gridded climate and remote sensing fields or by integrating data-driven or process-oriented terrestrial carbon cycle models. The first coordinated attempt to collect regional carbon budgets for nine regions covering the entire globe in the RECCAP-1 project has delivered estimates for the decade 2000–2009, but these budgets were not comparable between regions, due to different definitions and component fluxes reported or omitted. The recent recognition of lateral fluxes of carbon by human activities and rivers, that connect CO2 uptake in one area with its release in another also requires better definition and protocols to reach harmonized regional budgets that can be summed up to the globe and compared with the atmospheric CO2 growth rate and inversion results. In this study, for the international initiative RECCAP-2 coordinated by the Global Carbon Project, which aims as an update of regional carbon budgets over the last two decades based on observations, for 10 regions covering the globe, with a better harmonization that the precursor project, we provide recommendations for using atmospheric inversions results to match bottom-up carbon accounting and models, and we define the different component fluxes of the net land atmosphere carbon exchange that should be reported by each research group in charge of each region. Special attention is given to lateral fluxes, inland water fluxes and land use fluxes.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Université de Versai...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    https://doi.org/10.5194/gmd-20...
    Article . 2020 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    https://gmd.copernicus.org/art...
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Geoscientific Model Development (GMD)
    Article . 2022 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Geoscientific Model Development (GMD)
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Geoscientific Model Development
    Article . 2022
    Data sources: DOAJ
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    MPG.PuRe
    Article . 2020
    License: CC BY
    Data sources: MPG.PuRe
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Wageningen Staff Publications
    Article . 2022
    License: CC BY
    https://dx.doi.org/10.60692/vq...
    Other literature type . 2020
    Data sources: Datacite
    https://dx.doi.org/10.60692/am...
    Other literature type . 2020
    Data sources: Datacite
    https://dx.doi.org/10.60692/bz...
    Other literature type . 2022
    Data sources: Datacite
    https://dx.doi.org/10.60692/zf...
    Other literature type . 2022
    Data sources: Datacite
    Access Routes
    Green
    gold
    46
    citations46
    popularityTop 1%
    influenceTop 10%
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    visibility7
    visibilityviews7
    downloaddownloads13
    Powered by Usage counts
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Université de Versai...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      https://doi.org/10.5194/gmd-20...
      Article . 2020 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      https://gmd.copernicus.org/art...
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Geoscientific Model Development (GMD)
      Article . 2022 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Geoscientific Model Development (GMD)
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Geoscientific Model Development
      Article . 2022
      Data sources: DOAJ
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      MPG.PuRe
      Article . 2020
      License: CC BY
      Data sources: MPG.PuRe
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Wageningen Staff Publications
      Article . 2022
      License: CC BY
      https://dx.doi.org/10.60692/vq...
      Other literature type . 2020
      Data sources: Datacite
      https://dx.doi.org/10.60692/am...
      Other literature type . 2020
      Data sources: Datacite
      https://dx.doi.org/10.60692/bz...
      Other literature type . 2022
      Data sources: Datacite
      https://dx.doi.org/10.60692/zf...
      Other literature type . 2022
      Data sources: Datacite
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Jürgens, Hella; Haass, Wiltrud; Castañeda, Tamara R; Schürmann, Annette; +10 Authors

    AbstractObjective: The marked increase in the prevalence of obesity in the United States has recently been attributed to the increased fructose consumption. To determine if and how fructose might promote obesity in an animal model, we measured body composition, energy intake, energy expenditure, substrate oxidation, and several endocrine parameters related to energy homeostasis in mice consuming fructose.Research Methods and Procedures: We compared the effects of ad libitum access to fructose (15% solution in water), sucrose (10%, popular soft drink), and artificial sweetener (0% calories, popular diet soft drink) on adipogenesis and energy metabolism in mice.Results: Exposure to fructose water increased adiposity, whereas increased fat mass after consumption of soft drinks or diet soft drinks did not reach statistical significance (n = 9 each group). Total intake of energy was unaltered, because mice proportionally reduced their caloric intake from chow. There was a trend toward reduced energy expenditure and increased respiratory quotient, albeit not significant, in the fructose group. Furthermore, fructose produced a hepatic lipid accumulation with a characteristic pericentral pattern.Discussion: These data are compatible with the conclusion that a high intake of fructose selectively enhances adipogenesis, possibly through a shift of substrate use to lipogenesis.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Obesity Researcharrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Obesity Research
    Article
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
    Obesity Research
    Article . 2005 . Peer-reviewed
    License: Wiley Online Library User Agreement
    Data sources: Crossref
    Obesity Research
    Article . 2006
    Access Routes
    Green
    bronze
    264
    citations264
    popularityTop 1%
    influenceTop 1%
    impulseTop 1%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Obesity Researcharrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Obesity Research
      Article
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
      Obesity Research
      Article . 2005 . Peer-reviewed
      License: Wiley Online Library User Agreement
      Data sources: Crossref
      Obesity Research
      Article . 2006
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Mauricio Rodriguez-Lanetty; Paulina Kaniewska; Paul R. Campbell; David I. Kline; +5 Authors

    As atmospheric levels of CO(2) increase, reef-building corals are under greater stress from both increased sea surface temperatures and declining sea water pH. To date, most studies have focused on either coral bleaching due to warming oceans or declining calcification due to decreasing oceanic carbonate ion concentrations. Here, through the use of physiology measurements and cDNA microarrays, we show that changes in pH and ocean chemistry consistent with two scenarios put forward by the Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) drive major changes in gene expression, respiration, photosynthesis and symbiosis of the coral, Acropora millepora, before affects on biomineralisation are apparent at the phenotype level. Under high CO(2) conditions corals at the phenotype level lost over half their Symbiodinium populations, and had a decrease in both photosynthesis and respiration. Changes in gene expression were consistent with metabolic suppression, an increase in oxidative stress, apoptosis and symbiont loss. Other expression patterns demonstrate upregulation of membrane transporters, as well as the regulation of genes involved in membrane cytoskeletal interactions and cytoskeletal remodeling. These widespread changes in gene expression emphasize the need to expand future studies of ocean acidification to include a wider spectrum of cellular processes, many of which may occur before impacts on calcification.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ James Cook Universit...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    PLoS ONE
    Article . 2012 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    PLoS ONE
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    PLoS ONE
    Article . 2012
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    PLoS ONE
    Article . 2012
    Data sources: DOAJ
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Access Routes
    Green
    gold
    223
    citations223
    popularityTop 1%
    influenceTop 10%
    impulseTop 1%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ James Cook Universit...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      PLoS ONE
      Article . 2012 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      PLoS ONE
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      PLoS ONE
      Article . 2012
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      PLoS ONE
      Article . 2012
      Data sources: DOAJ
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Sebastien Carnicella; Patricia H. Janak; Dorit Ron; Somayeh Ahmadiantehrani;

    Background:  We previously found that activation of the glial cell line‐derived neurotrophic factor (GDNF) pathway in the ventral tegmental area (VTA) reduces ethanol‐drinking behaviors. In this study, we set out to assess the contribution of endogenous GDNF or its receptor GFRα1 to the regulation of ethanol‐related behaviors.Methods:  GDNF and GFRα1 heterozygote mice (HET) and their wild‐type littermate controls (WT) were used for the studies. Ethanol‐induced hyperlocomotion, sensitization, and conditioned place preference (CPP), as well as ethanol consumption before and after a period of abstinence were evaluated. Blood ethanol concentration (BEC) was also measured.Results:  We observed no differences between the GDNF HET and WT mice in the level of locomotor activity or in sensitization to ethanol‐induced hyperlocomotion after systemic injection of a nonhypnotic dose of ethanol and in BEC. However, GDNF and GFRα1 mice exhibited increased place preference to ethanol as compared with their WT littermates. The levels of voluntary ethanol or quinine consumption were similar in the GDNF HET and WT mice, however, a small but significant increase in saccharin intake was observed in the GDNF HET mice. No changes were detected in voluntary ethanol, saccharin or quinine consumption of GFRα1 HET mice as compared with their WT littermates. Interestingly, however, both the GDNF and GFRα1 HET mice consumed much larger quantities of ethanol after a period of abstinence from ethanol as compared with their WT littermates. Furthermore, the increase in ethanol consumption after abstinence was found to be specific for ethanol as similar levels of saccharin intake were measured in the GDNF and GFRα1 HET and WT mice after abstinence.Conclusions:  Our results suggest that endogenous GDNF negatively regulates the rewarding effect of ethanol and ethanol‐drinking behaviors after a period of abstinence.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Alcoholism Clinical ...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
    Alcoholism Clinical and Experimental Research
    Article . 2009 . Peer-reviewed
    License: Wiley Online Library User Agreement
    Data sources: Crossref
    Access Routes
    Green
    bronze
    38
    citations38
    popularityTop 10%
    influenceTop 10%
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Alcoholism Clinical ...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
      Alcoholism Clinical and Experimental Research
      Article . 2009 . Peer-reviewed
      License: Wiley Online Library User Agreement
      Data sources: Crossref
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Juanjo Rodríguez; Christine M. J. Gallampois; Sari Timonen; Agneta Andersson; +9 Authors

    Coastal ecosystems are highly dynamic and can be strongly influenced by climate change, anthropogenic activities (e.g., pollution), and a combination of the two pressures. As a result of climate change, the northern hemisphere is predicted to undergo an increased precipitation regime, leading in turn to higher terrestrial runoff and increased river inflow. This increased runoff will transfer terrestrial dissolved organic matter (tDOM) and anthropogenic contaminants to coastal waters. Such changes can directly influence the resident biology, particularly at the base of the food web, and can influence the partitioning of contaminants and thus their potential impact on the food web. Bacteria have been shown to respond to high tDOM concentration and organic pollutants loads, and could represent the entry of some pollutants into coastal food webs. We carried out a mesocosm experiment to determine the effects of: (1) increased tDOM concentration, (2) organic pollutant exposure, and (3) the combined effect of these two factors, on pelagic bacterial communities. This study showed significant responses in bacterial community composition under the three environmental perturbations tested. The addition of tDOM increased bacterial activity and diversity, while the addition of organic pollutants led to an overall reduction of these parameters, particularly under concurrent elevated tDOM concentration. Furthermore, we identified 33 bacterial taxa contributing to the significant differences observed in community composition, as well as 35 bacterial taxa which responded differently to extended exposure to organic pollutants. These findings point to the potential impact of organic pollutants under future climate change conditions on the basal coastal ecosystem, as well as to the potential utility of natural bacterial communities as efficient indicators of environmental disturbance.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Frontiers in Microbi...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Frontiers in Microbiology
    Article . 2018 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Frontiers in Microbiology
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Frontiers in Microbiology
    Article . 2018
    Data sources: DOAJ
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Access Routes
    Green
    gold
    31
    citations31
    popularityTop 10%
    influenceAverage
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Frontiers in Microbi...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Frontiers in Microbiology
      Article . 2018 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Frontiers in Microbiology
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Frontiers in Microbiology
      Article . 2018
      Data sources: DOAJ
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/

    Bien que des données pharmacologiques et biochimiques antérieures soutiennent l'idée que les récepteurs muscariniques de l'acétylcholine (mAChR) forment des homo- et hétérodimères, l'existence d'oligomères mAChR dans les cellules vivantes reste controversée. Ici, nous avons utilisé le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence pour démontrer que les mAChR M1, M2 et M3 peuvent former des homo- et hétérodimères constitutifs dans les cellules HEK 293 vivantes. L'analyse quantitative du transfert d'énergie par résonance de bioluminescence a révélé que la population de récepteurs cellulaires dans les cellules exprimant un seul sous-type de M1, M2 ou M3 mAChR est principalement composée d'homodimères de haute affinité. L'analyse de la courbe de saturation des cellules exprimant deux sous-types de récepteurs démontre l'existence d'hétérodimères mAChR de haute affinité M1/M2, M2/M3 et M1/M3, bien que les valeurs d'affinité relative soient légèrement inférieures à celles des homodimères mAChR. Le traitement agoniste à court terme n'a pas modifié le statut oligomérique des homo- et hétérodimères. Lorsqu'il est exprimé dans les cellules JEG-3, le récepteur M2 présente une sensibilité beaucoup plus élevée que le récepteur M3 à la régulation négative induite par les agonistes. La co-expression de M3 mAChR avec des quantités croissantes du sous-type M2 dans les cellules JEG-3 a entraîné une régulation négative accrue de M3 induite par les agonistes, suggérant un nouveau rôle de l'hétérodimérisation dans le mécanisme de la régulation à long terme de mAChR. Bien que des données pharmacologiques et biochimiques antérieures soutiennent l'idée que les récepteurs muscariniques de l'acétylcholine (mAChR) forment des homo- et hétérodimères, l'existence d'oligomères mAChR dans les cellules vivantes reste controversée. Ici, nous avons utilisé le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence pour démontrer que les mAChR M1, M2 et M3 peuvent former des homo- et hétérodimères constitutifs dans les cellules HEK 293 vivantes. L'analyse quantitative du transfert d'énergie par résonance de bioluminescence a révélé que la population de récepteurs cellulaires dans les cellules exprimant un seul sous-type de M1, M2 ou M3 mAChR est principalement composée d'homodimères de haute affinité. L'analyse de la courbe de saturation des cellules exprimant deux sous-types de récepteurs démontre l'existence d'hétérodimères mAChR de haute affinité M1/M2, M2/M3 et M1/M3, bien que les valeurs d'affinité relative soient légèrement inférieures à celles des homodimères mAChR. Le traitement agoniste à court terme n'a pas modifié le statut oligomérique des homo- et hétérodimères. Lorsqu'il est exprimé dans les cellules JEG-3, le récepteur M2 présente une sensibilité beaucoup plus élevée que le récepteur M3 à la régulation négative induite par les agonistes. La co-expression de M3 mAChR avec des quantités croissantes du sous-type M2 dans les cellules JEG-3 a entraîné une régulation négative accrue de M3 induite par les agonistes, suggérant un nouveau rôle de l'hétérodimérisation dans le mécanisme de la régulation à long terme de mAChR. Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études ont montré de nombreuses preuves que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) 3Les abréviations utilisées sont : RCPG, récepteur couplé aux protéines G ; mAChR, récepteur muscarinique de l'acétylcholine ; TMD, domaine transmembranaire ; BRET, transfert d'énergie par résonance de bioluminescence ; RLuc, Renilla luciférase ; YFP, protéine de fluorescence jaune, GFP, protéine de fluorescence verte ; Smo, lissé ; QNB, benzilate de quinuclidinyle ; i3, troisième boucle intracellulaire ; PBS, solution saline tamponnée au phosphate ; HA, hémagglutinine. interagissent les uns avec les autres pour former des homo- ou hétéro-oligomères constitutifs. La dimérisation des RCPG a été impliquée dans de nombreux aspects de la pharmacologie des récepteurs, tels que la maturation, la liaison aux ligands, l'activation, la signalisation, la désensibilisation, l'endocytose et le trafic (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001 ; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002 ; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 3Breitwieser G.E. Circ. Res. 2004 ; 94: 17-27Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). Au début des années 1990, plusieurs études ont montré que les récepteurs muscariniques de l'acétylcholine (mAChR), comme les autres GPCR, pouvaient être organisés en complexes dimères ou oligomères. Des courbes de liaison complexes pour les agonistes et les antagonistes muscariniques ont été interprétées comme des preuves de l'existence de multiples états d'affinité, ce qui est cohérent avec la notion de sites de liaison situés sur des molécules réceptrices dimériques (4Hirschberg B.T. Schimerlik M.I. J. Biol. Chem. 1994 ; 269: 26127-26135Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 5Potter L.T. Ballesteros L.A. Bichajian L.H. Ferrendelli c.a. Fisher A. Hanchett H.E. Zhang R. Mol. Pharmacol. 1991 ; 39: 211-221PubMed Google Scholar). Des études plus récentes sur le mAChR ont montré qu'une telle hétérogénéité d'affinité devrait plutôt être attribuée à des effets coopératifs sensibles aux nucléotides entre sites d'interaction (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992 ; 31: 10908-10921Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar, 7Chidiac P. Green M.A. Pawagi A.B. Wells J.W. Biochemistry. 1997 ; 36: 7361-7379Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar). Parce qu'il semble y avoir un site de liaison par molécule réceptrice, la coopérativité suggère que les mAChR sont en fait des oligomères formés par deux ou plusieurs sites en interaction (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992 ; 31: 10908-10921Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar). Des preuves pharmacologiques supplémentaires que le mAChR peut former des dimères ont été fournies par Maggio et al. (8Maggio R. Vogel Z. Wess J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993 ; 90: 3103-3107Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar), qui a utilisé des récepteurs muscariniques α2-adrénergiques/M3 chimériques composés des cinq premiers domaines transmembranaires (TMD) d'un récepteur et des deux derniers TMD de l'autre. Aucune liaison ou signalisation n'a été détectée lorsque l'une ou l'autre des protéines de fusion a été exprimée seule, mais la coexpression des deux chimères a sauvé l'activité de liaison et les propriétés de signalisation des ligands adrénergiques et muscariniques. Ces résultats ont été interprétés comme des interactions intermoléculaires entre deux récepteurs inactifs maintenant engagés dans un complexe dimérique avec des propriétés fonctionnelles de récepteur restaurées. Cependant, de tels résultats de transcomplémentation ont été contestés en raison du fait que ces interactions intermoléculaires ont été observées en étudiant les récepteurs mutants et non les récepteurs de type sauvage (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001 ; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). La co-immunoprécipitation du mAChR M3 marqué à l'épitope solubilisé et l'analyse par Western blot ont également été utilisées pour démontrer l'existence d'oligomères mAChR de manière directe. Cette approche biochimique a révélé que le M3 mAChR est capable de former des dimères/multimères liés au disulfure ainsi que des dimères/multimères non covalents (9Zeng F.Y. Wess J.J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 19487-19497Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (215) Google Scholar). Bien que les essais de co-immunoprécipitation/immunoblotting fournissent des preuves assez convaincantes de la formation de dimères mAChR, de telles études ont été critiquées pour la possibilité que l'agrégation des récepteurs observée puisse résulter d'un artefact en raison de la présence de préparations concentrées de molécules hautement hydrophobes après le processus de solubilisation (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001 ; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). Au cours de la dernière décennie, plusieurs groupes ont utilisé des essais biophysiques basés sur le transfert d'énergie par résonance lumineuse pour évaluer l'oligomérisation des RCPG (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001 ; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002 ; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004 ; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar, 11Angers S. Salahpour A. Joly E. Hilairet S. Chelsky D. Dennis M. Bouvier M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000 ; 97: 3684-3689PubMed Google Scholar). Le transfert d'énergie de résonance de fluorescence et sa variation, le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET), ont été largement utilisés pour surmonter les limitations technologiques présentes dans les méthodes pharmacologiques et biochimiques car ils ont l'avantage distinct de surveiller les interactions en temps réel entre les protéines synthétisées dans leur emplacement correct dans les cellules vivantes (10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004 ; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar). Dans la méthodologie classique de BRET, la première protéine est fusionnée à la luciférase de Renilla (RLuc), et la deuxième protéine partenaire est fusionnée à une protéine fluorescente (protéine fluorescente jaune (YFP)). Si les deux partenaires interagissent, le transfert d'énergie de résonance entre le RLuc (donneur) et le YFP (accepteur) peut être mesuré lors de l'ajout du substrat RLuc coelentérazine (12Xu Y. Piston D.W. Johnson C.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999 ; 96: 151-156Crossref PubMed Scopus (507) Google Scholar). Dans cette étude, l'occurrence d'homo- et hétéro-oligomères constitutifs parmi les mAChR M1, M2 et M3 a été étudiée dans des cellules vivantes exprimant des niveaux physiologiques de ces récepteurs par BRET. Des expériences de saturation BRET ont été menées pour estimer la capacité relative de chaque sous-type de récepteur à s'engager dans des interactions homo- et hétérotrope. La nature de ces homo-oligomères, la proportion de molécules réceptrices formant ces complexes oligomères et l'effet de l'agoniste muscarinique sur l'homo- et l'hétérodimérisation des mAChR M1, M2 et M3 ont également été abordés. Enfin, nous avons examiné les implications de l'oligomérisation sur la fonction mAChR en déterminant l'effet de l'hétérodimérisation M2/M3 sur la régulation mAChR M3 induite par les agonistes. Matériaux - Le benzilate de [3H] quinuclidinyle ([3H]QNB, 42 Ci/mmol) et la N-[3H]méthylscopolamine (81 Ci/mmol) ont été achetés auprès d'Amersham Biosciences. Le milieu modifié Eagle's de Dulbecco, la pénicilline/streptomycine et le sérum bovin fœtal ont été achetés chez Invitrogen. Les enzymes de restriction provenaient de New England Biolabs (Beverly, MA) et la coelentérazine h a été obtenue de Promega (Madison, WI). L'anticorps polyclonal anti-HA (HA.11) a été acheté à Covance (Berkeley, CA). Le chlorure de carbamylcholine (carbachol), le sulfate d'atropine, l'anticorps monoclonal anti-FLAG M2 et tous les autres réactifs ont été achetés auprès de Sigma. L'anticorps monoclonal contre le M2 mAChR cardiaque porcin a été généré et caractérisé par Luetje et al. (13Luetje C.W. Brumwell C. Norman M.G. Peterson G.L. Schimerlik M.I. Nathanson N.M. Biochemistry. 1987 ; 26: 6892-6896Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Les protéines de fusion mAChR-RLuc et mAChR-YFP ont été construites en ligaturant la luciférase de Renilla (RLuc) et les fractions YFP à l'extrémité C-terminale des récepteurs. Les séquences codantes M1, M2 porcine et M3 mAChR humaines sans leurs codons stop ont été amplifiées en utilisant des amorces sens et antisens hébergeant des sites de restriction uniques. Les fragments ont ensuite été sous-clonés dans le cadre dans pRL-CMV-RLuc (Promega) ou pEYFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA). Les sites de restriction utilisés étaient les suivants : XhoI/BamHI (M1-RLuc, M1-YFP), XhoI/SacII (M2-RLuc, M2-YFP), EcoRV/BamHI (M3-RLuc) et EcoRI/BamHI (M3-YFP). pEYFP a été coupé avec AgeI et BsrGI, et le fragment YFP a été inséré dans le site AgeI/BsrGI à partir de Smoothened-GFP humain (Smo-GFP) pour donner Smo-YFP. Smo-GFP a été fourni par le Dr A. Kaykas (Université de Washington). Le plasmide d'expression HA-M3 mAChR a été obtenu auprès du Centre de ressources en ADNc de l'Université du Missouri-Rolla (Rolla, MO). Toutes les autres constructions ont été décrites ailleurs (14Nadler L.S. Kumar G. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 10539-10547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar, 15Kaykas A. Yang-Snyder J. Héroux M. Shah K.V. Bouvier M. Moon R.T. Nat. Cell Biol. 2004 ; 6: 52-58Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). Culture et transfection cellulaires : des cellules HEK 293 ou JEG-3 ont été cultivées dans le milieu Eagle's modifié de Dulbecco supplémenté avec 10% (v/v) de sérum bovin fœtal et de pénicilline (100 unités/ml)/sulfate de streptomycine (0,1 mg/ml) à 37 °C dans un environnement humidifié à 10% de CO2. Des transfections transitoires ont été effectuées sur des cellules qui étaient à 70–80% de confluence en utilisant le protocole de précipitation de phosphate de calcium (16Mellon P. Parker V. Gluzman Y. Maniatis T. Cell. 1981 ; 27: 279-288Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (335) Google Scholar). La caractérisation pharmacologique des constructions - Les cellules HEK 293 cultivées dans des boîtes de 15 cm ont été transfectées avec un RAChR marqué au RLuc, marqué au YFP ou non marqué (12,5-25 μg d'ADN/plaque). Après une période de 36 h après la transfection, les cellules ont été lavées avec du PBS glacé et les membranes ont été obtenues comme décrit précédemment (17 Goin J.C. Nathanson N.M. J. Neurochem. 2002 ; 83: 964-972Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar). Des études de liaison à la saturation ont été réalisées en incubant des membranes avec des concentrations croissantes de [3H]QNB à 37 °C pendant 90 min dans du phosphate de sodium/potassium de 50 mm, pH 7,4. L'atropine (1 μm) a été utilisée pour définir la liaison non spécifique. La réaction a été arrêtée par filtration rapide sur filtres en fibre de verre GF/C (Whatman). Les filtres ont ensuite été lavés quatre fois avec du tampon phosphate froid, et la radioactivité retenue a été déterminée par comptage par scintillation. Les courbes ont été analysées par analyse de régression non linéaire à l'aide du logiciel Prism 4 (GraphPad, San Diego). Dosages de BRET - Trente six heures après la transfection, les cellules HEK 293 ont été distribuées dans des microplaques de 96 puits (Isoplate opaque blanc, Wallac) lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remises en suspension dans du PBS/glucose 0,1% en présence ou en l'absence de 10 μm de carbachol à 25 °C. La coélentérazine h a été ajoutée à une concentration finale de 5 μm et l'intensité lumineuse a été intégrée séquentiellement dans les fenêtres 510–590 et 440–500 nm à l'aide d'un lecteur multiplaques Victor2 (PerkinElmer Life Sciences). LE rapport de BRET a été défini comme ((émission à 510-590)/(émission à 440–500)) – Cf, où Cf correspondait à (émission à 510-590)/(émission à 440–500) pour les constructions du récepteur RLuc exprimées seules dans les mêmes expériences. Mesures de fluorescence et de luminescence - Les cellules HEK 293 transfectées de manière transitoire ont été récoltées, lavées et remises en suspension comme décrit ci-dessus, puis distribuées dans des microplaques à 96 puits (isoplates opaques à fond clair ou blancs pour les déterminations de fluorescence et de luminescence, respectivement). Les deux déterminations ont également été réalisées dans un lecteur multiplaques Victor2. La fluorescence totale des cellules a été mesurée à l'aide d'un filtre d'excitation de 485 nm et d'un filtre d'émission de 535 nm. Pour évaluer l'activité de la luciférase de Renilla, la luminescence totale a été déterminée sur des échantillons incubés avec de la coélentérazine de 5 μm. Pour les deux mesures, les moyennes de puits en double ont été calculées. Les valeurs de fluorescence totale ont ensuite été divisées par le fond déterminé dans des puits contenant des cellules non transfectées. Les valeurs de fond pour la luminescence totale étaient négligeables, et elles ont été soustraites des valeurs de l'échantillon. Titrage des protéines de fusion donneuses et acceptrices - Les niveaux d'expression des constructions mAChR-RLuc et mAChR-YFP ont été surveillés en mesurant la luminescence et la fluorescence, respectivement, comme décrit ci-dessus. Cette procédure est basée sur l'observation que les niveaux de luminescence et de fluorescence de plusieurs protéines de fusion récepteur-RLuc et récepteur-YFP (ou récepteur-GFP) ont été trouvés en corrélation linéaire avec les nombres de récepteurs (18Ayoub M.A. Levoye A. Delagrange P. Jockers R. Mol. Pharmacol. 2004 ; 66: 312-321Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). Parce que cette corrélation est une propriété intrinsèque de chaque protéine de fusion, nous avons testé si nos protéines de fusion mAChR suivaient un modèle de corrélation linéaire. Ainsi, nous avons exprimé chaque mAChR-RLuc ou mAChR-YFP à différents niveaux dans les cellules HEK 293 et évalué la relation entre l'activité luciférase ou la fluorescence, respectivement, et la quantité de sites de liaison mAChR dans les mêmes cellules. Trente-six heures après la transfection, environ20 000 cellules HEK 293 ont été incubées avec 1 nm [3H]QNB dans du PBS, 0,1% de glucose pendant 90 min à 25 °C. La liaison non spécifique a été déterminée en présence de 1 μm d'atropine. La réaction a été arrêtée par filtration rapide sur des filtres en fibre de verre GF/C, qui ont ensuite été lavés quatre fois avec du PBS froid. La radioactivité retenue a été déterminée comme décrit ci-dessus. La luminescence et la fluorescence (unités arbitraires) ont été tracées par rapport aux sites de liaison totaux, et des courbes de régression linéaire ont été obtenues (Fig. 2). Ces courbes standard générées pour chaque expérience ont été utilisées pour transformer les valeurs de fluorescence et de luminescence en femtomoles de récepteur. Ainsi, les rapports fluorescence/luminescence ont été transformés en rapports (récepteur-YFP)/(récepteur-RLuc), ce qui nous a permis de déterminer des valeurs précises de BRETmax et de BRET50 (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M.J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). La concentration en protéines des échantillons a été déterminée pour contrôler le nombre de cellules et également pour exprimer les nombres de récepteurs en femtomole/mg de protéine cellulaire totale, en utilisant la méthode standard décrite par Lowry et al. (20Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. Randall R.J.J. Biol. Chem. 1951 ; 193: 265-275Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Receptor Down-regulation Assays—Determination of agonist-induced M2 or M3 mAChR down-regulation was achieved using the binding of the membrane-permeable muscarinic ligand [3H]QNB to intact cells expressed either mAChR subtype, as described previously (21Schlador M.L. Grubbs R.D. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 2000 ; 275: 23295-23302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (33) Google Scholar). Brièvement, les cellules JEG-3 ont été transfectées de manière transitoire avec des constructions d'ADN M2 ou FLAG-M3 mAChR. Quarante-huit heures plus tard, les cellules ont été incubées soit avec 1 mm de carbachol pendant différents temps (dans un intervalle de 0 à 12 h), soit en présence de diverses concentrations de carbachol pendant 12 h à 37 °C. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS glacé et marquées avec une concentration saturante de [3H]QNB (∼1 nm) dans du PBS pendant 90 min à 37 °C. La liaison non spécifique a été déterminée en présence de 1 μm d'atropine. Les cellules marquées ont été lavées avec du PBS glacé et filtrées sur des filtres à membrane GF/C (Whatman). Les filtres ont ensuite été lavés avec du PBS glacé, transférés dans des flacons de scintillation et combinés avec du liquide de scintillation avant la détermination de la radioactivité par comptage de scintillation. La régulation négative des cellules M2 et M3 mAChR—JEG-3 co-exprimées a été transfectée avec M2 mAChR, FLAG-M3 mAChR, ou les deux constructions d'ADN à des proportions différentes en suivant la procédure indiquée ci-dessus. Quarante-huit heures après la transfection, les cellules ont été traitées avec 10 μm de carbachol pendant 12 h à 37 °C. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS glacé, récoltées dans un tampon phosphate de sodium/potassium de 50 mm, pH 7,4, supplémentées avec des inhibiteurs de protéase (10 μg/ml de leupeptine, 70 μg/ml de fluorure de phénylméthanesulfonyle et 0,25 μg/ml de pepstatine A), et ont été homogénéisées en verre. Les membranes ont été obtenues comme décrit précédemment (17 Goin J.C. Nathanson N.M. J. Neurochem. 2002 ; 83: 964-972Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar), et le nombre total de mAChR dans les homogénats membranaires bruts a été déterminé en utilisant la liaison de [3H]QNB telle que décrite par Halvorsen et Nathanson (22Halvorsen S.W. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1981 ; 256: 7941-7948Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Les nombres de M2 et FLAG-M3 mAChR ont été mesurés par le test d'immunoprécipitation décrit précédemment (23McKinnon L.A. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1995 ; 270: 20636-20642Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar) en utilisant des anticorps monoclonaux anti-M2 et anti-FLAG, respectivement. Alternativement, des expériences de contrôle ont été réalisées en cotransfectant des cellules avec FLAG-M3 mAChR et HA-M3 mAChR à différents niveaux d'expression relative, tels que déterminés par immunoprécipitation en utilisant des anticorps anti-FLAG et anti-HA (23McKinnon L.A. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1995 ; 270: 20636-20642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar). L'étendue de la régulation négative du FLAG-M3 après le traitement au carbachol a ensuite été déterminée comme indiqué ci-dessus. Analyse des données - Les courbes de saturation de bret ont été analysées à l'aide du logiciel Prism 4. Les isothermes ont été ajustées à l'aide d'une équation de régression non linéaire en supposant un seul site de liaison, ce qui a fourni les valeurs BRETmax et BRET50. La corrélation entre la fluorescence ou la luminescence et la densité des récepteurs a été analysée par ajustement de la courbe de régression linéaire avec le même logiciel. La signification statistique des différences dans la régulation du mAChR M2 versus M3 a été évaluée par le test t de Student bilatéral non apparié. L'homo- et l'hétérodimérisation des mAChR M1, M2 et M3 ont été évaluées dans des cellules HEK 293 vivantes par analyse quantitative de BRET. À cette fin, les trois sous-types de mAChR ont été fusionnés au niveau de leur terminaison C au donneur d'énergie RLuc ou à l'accepteur YFP. Pour nous assurer que les protéines de fusion exprimées étaient des polypeptides correctement repliés capables de se lier aux ligands muscariniques, nous avons évalué leurs propriétés de liaison par des tests de liaison à la saturation utilisant l'antagoniste muscarinique [3H]QNB. Une analyse détaillée des valeurs de Kd obtenues à partir de ces courbes de saturation (tableau 1) a indiqué que les modifications à l'extrémité C terminale des mAChR M1, M2 et M3 ne modifiaient pas significativement l'affinité pour le radioligand muscarinique par rapport aux récepteurs de type sauvage. Dans un autre ensemble d'expériences, toutes les constructions ont été exprimées individuellement dans les cellules HEK 293, et la liaison du ligand muscarinique imperméable à la membrane N-[3H]méthylscopolamine a été déterminée en parallèle avec la liaison de l'antagoniste muscarinique perméable à la membrane [3H]QNB à des concentrations de radioligand saturantes pour chaque récepteur exprimé. Parce qu'aucune différence significative n'a été trouvée entre les niveaux de liaison des deux radioligands au même récepteur, 4J. C. Goin et N. M. Nathanson, observations non publiées. nous avons conclu que toutes les protéines de fusion sont exprimées à la surface cellulaire et qu'une telle colocalisation assure leurs chances d'interagir les unes avec les autres.TABLE 1Paramètres de liaison des constructions M1, M2 et M3 mAChRConstruireKdpmM1 mAChR-RLuc13.7 ± 0,9M1 mAChR-YFP13.0 ± 0,7WT-M1 mAChR11.7 ± 2,0M2 mAChR-RLuc19.4 ± 2,0M2 mAChR-YFP24.6 ± 3,3WT-M2 mAChR24.0 ± 2,8M3 mAChR-RLuc38.6 ± 3,2M3 mAChR-YFP33.6 ± 4,2WT-M3 mAChR37.8 ± 2,5 Ouvrir la table dans un nouvel onglet Pour déterminer si M1, M2 et M3 mAChR peuvent former des homodimères dans des cellules intactes, nous avons évalué la capacité des mAChR et mAChR étiquetés par RLuc et YFP à interagir les uns avec les autres par analyse de la courbe de Breturation. Les cellules HEK 293 ont été co-transfectées de manière transitoire avec une quantité constante de la construction RLuc et des quantités croissantes de la construction YFP, et le transfert d'énergie entre les deux protéines de fusion a été mesuré lors de l'addition du substrat de la luciférase Renilla, la cœlentérazine h. Les niveaux d'expression de chaque récepteur marqué RLuc ont été évalués par détection de la luminescence totale de la réaction de luciférase précédente, et les niveaux d'expression des récepteurs marqués YFP ont été surveillés par détermination de la fluorescence totale. Parce que les niveaux d'expression des constructions RLuc ont été trouvés modifiés par la co-transfection de quantités croissantes de leurs partenaires YFP, les signaux BRET ont été tracés en fonction du rapport fluorescence/luminescence. La co-expression des molécules donneuses M1, M2 ou M3 avec leurs partenaires accepteurs homologues a entraîné des isothermes de saturation classiques (Fig. 1, A–C), dans laquelle les signaux de BRET augmentent en fonction hyperbolique de la concentration de l'accepteur, atteignant une asymptote qui correspond à la saturation de tous les donneurs de BRET par les molécules acceptrices. Cette observation suggère que les mAChR M1, M2 et M3 forment des homodimères constitutifs dans les cellules vivantes. Pour nous assurer que ces signaux BRET ne résultaient pas d'une interaction parasite entre RLuc et YFP, nous avons effectué des tests de contrôle dans lesquels chaque mAChR marqué par RLuc était coexprimé avec des quantités croissantes de YFP soluble. Ces essais de saturation ont donné lieu à des courbes quasi-linéaires montrant des signaux de BRET marginaux, qui indiquent une interaction non spécifique entre les deux partenaires coexprimés dans chaque cas. La sélectivité de l'interaction entre le donneur et l'accepteur mAChR a ensuite été évaluée pour exclure la possibilité de signaux BRET non spécifiques en raison de la surexpression des protéines transmembranaires. Le récepteur de signalisation transmembranaire sept apparenté à distance Smoothened fusionné à YFP (Smo-YFP) a été cotransfecté avec M1, M2 ou M3 mAChR-RLuc, ce qui a entraîné une diminution spectaculaire du rapport BRET pour les trois mAChR testés. En revanche, la coexpression de Smo-RLuc avec des quantités croissantes de Smo-YFP a donné des niveaux de BRET significativement plus élevés (figure supplémentaire 1), indiquant que Smo-RLuc est effectivement capable de former des dimères constitutifs dans des cellules intactes lorsqu'il est coexprimé avec un partenaire spécifique. Les données de BRET n'ont pas été influencées par la position relative de RLuc ou de YFP sur les paires de récepteurs car des résultats identiques ont été obtenus pour l'orientation réciproque. 4J. C. Goin et N. M. Nathanson, observations inédites. Ces données confirment notre observation précédente, indiquant que les protéines de fusion donneur et accepteur M1, M2 et M3 sont engagées dans des interactions spécifiques en tant qu'homodimères constitutifs. Bien que les courbes de saturation présentées précédemment suggèrent que le donneur et l'accepteur M1, M2 et M3 interagissent spécifiquement les uns avec les autres, elles ne fournissent pas suffisamment d'informations sur les paramètres de liaison requis pour une analyse quantitative appropriée des interactions récepteur-récepteur. Par conséquent, nous avons mené un nouvel ensemble d'expériences de saturation dans lesquelles la quantité de chaque récepteur effectivement exprimée dans les cellules transfectées a été surveillée, pour chaque expérience individuelle, en corrélant à la fois la luminescence totale et la fluorescence totale avec le nombre de sites de liaison au [3H] QNB. L'analyse de cette corrélation montre une relation linéaire entre la luminescence totale et la densité des récepteurs sans différences significatives entre les pentes obtenues pour les trois sous-types de récepteurs mAChR (figure supplémentaire 2). L'analyse de corrélation entre la fluorescence totale et le nombre total de récepteurs a également donné des courbes linéaires. Cependant, la pente obtenue pour M1-YFP était significativement plus élevée que celle obtenue pour M2-YFP ou M3-YFP. Les équations de régression linéaire présentées dans la figure 2 supplémentaire ont été utilisées pour transformer les unités de fluorescence et de luminescence en nombres de récepteurs, et les signaux BRET ont été tracés en fonction du rapport (nombre de récepteurs-YFP)/(nombre de récepteurs-RLuc). Ces nouvelles courbes de saturation de BRET se sont également comportées comme des fonctions hyperboliques atteignant un niveau de saturation (Fig. 2). Selon l'analyse classique de l'interaction protéine-protéine surveillée par BRET en supposant un site de liaison, la concentration de l'accepteur donnant 50% du transfert d'énergie (BRET50) explique l'affinité relative entre les deux protomères en interaction, et le signal BRET maximal dépend du nombre total de dimères formés ainsi que de la distance entre le donneur et l'accepteur dans le dimère (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M.J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Lors de la comparaison des courbes obtenues pour les homodimères mAChR M1, M2 et M3 (tableau 2), aucune différence significative dans les valeurs de BRET50 n'a été trouvée, indiquant que les affinités des protomères les uns pour les autres sont similaires parmi les trois sous-types de mAChR étudiés. D'autre part, la valeur BRETmax pour la paire donneur-accepteur M1 s'est avérée significativement différente de celle des homodimères M2 et M3. En effet, le BRETmax pour la paire M1-RLuc/M1-YFP était plus de deux fois plus élevé que les autres valeurs de BRETmax. Cela pourrait indiquer qu'un pourcentage plus élevé du sous-type M1 est engagé dans l'homodimérisation ou que le transfert d'énergie entre RLuc et YFP au sein de l'homodimère M1 est plus efficace que celui des homodimères M2 et M3. Comme les affinités relatives entre chacun des partenaires se sont avérées très similaires entre les trois sous-types de récepteurs (tableau 2), la deuxième hypothèse est plus probable. De plus, le fait que les courbes de corrélation entre la fluorescence totale et la densité des récepteurs aient donné une valeur de pente plus élevée pour M1 suggère que YFP fonctionne comme un accepteur plus efficace lorsqu'il est fusionné au sous-type de récepteur M1, ce qui peut entraîner des valeurs de BRET plus élevées pour cette paire. 2Homodimérisation de M1, M2 et M3 mAChR ; paramètres des courbes de saturation de BretPaire transfectéeBRETmaxBRET50% des récepteurs existants en tant qu'homo-oligomères dimères M1-RLuc/M1-YFP0.285 ± 0.0071.83 ± 0.1472 ± 4M2-RLuc/M2-YFP0.139 ± 0.0041.70 ± 0.2378 ± 8M3-RLuc/M3-YFP0.128 ± 0.0031.41 ± 0.1383 ± 6 Tableau ouvert dans un nouvel onglet Pour évaluer la nature des homo-oligomères M1, M2 et M3 mAChR, nous avons comparé leurs courbes de saturation expérimentales correspondantes (Fig. 2) avec celles attendues pour les complexes dimères, trimères et tétramères en utilisant une modification de l'équation par Veatch et Stryer (24Veatch W. Stryer L. Mol J. Biol. 1977 ; 113: 89-102Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar). Cette formule décrit la probabilité de formation de complexes BRET-compétents en fonction de la taille oligomérique du récepteur (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M.J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Les courbes expérimentales correspondent mieux à la courbe théorique prédite pour un dimère plutôt qu'à celles attendues pour un trimère ou un tétramère, suggérant que la fraction oligomère des populations M1, M2 ou M3 mAChR est principalement composée de complexes dimères (Fig. 3). Analyse quantitative détaillée de l'homodimérisation des récepteurs β2-adrénergiques par Mercier et al. (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M.J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 44925-44931Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar) suggère qu'il est possible d'estimer la proportion de récepteurs engagés dans la dimérisation. En supposant un équilibre libre entre les protéines de fusion donneur et accepteur, seulement 50 % des dimères devraient générer BRET si les deux partenaires sont exprimés à des concentrations équimolaires, car chaque partenaire peut également générer 25 % d'homodimères entre des molécules identiques. Aunque los datos farmacológicos y bioquímicos anteriores respaldan la noción de que los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR) forman homo y heterodímeros, la existencia de oligómeros de mAChR en células vivas sigue siendo motivo de controversia. Aquí utilizamos la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia para demostrar que mAChR M1, M2 y M3 puede formar homo y heterodímeros constitutivos en células HEK 293 vivas. El análisis cuantitativo de transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia ha revelado que la población de receptores celulares en células que expresan un solo subtipo de mAChR M1, M2 o M3 está compuesta predominantemente por homodímeros de alta afinidad. El análisis de la curva de saturación de las células que expresan dos subtipos de receptores demuestra la existencia de heterodímeros mAChR M1/M2, M2/M3 y M1/M3 de alta afinidad, aunque los valores de afinidad relativa fueron ligeramente inferiores a los de los homodímeros mAChR. El tratamiento con agonistas a corto plazo no modificó el estado oligomérico de los homodímeros y heterodímeros. Cuando se expresa en células JEG-3, el receptor M2 exhibe una susceptibilidad mucho mayor que el receptor M3 a la regulación negativa inducida por agonistas. La coexpresión de M3 mAChR con cantidades crecientes del subtipo M2 en células JEG-3 dio como resultado una mayor regulación negativa de M3 inducida por agonistas, lo que sugiere un nuevo papel de la heterodimerización en el mecanismo de regulación a largo plazo de mAChR. Aunque los datos farmacológicos y bioquímicos anteriores respaldan la noción de que los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR) forman homo y heterodímeros, la existencia de oligómeros de mAChR en células vivas sigue siendo motivo de controversia. Aquí utilizamos la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia para demostrar que mAChR M1, M2 y M3 puede formar homo y heterodímeros constitutivos en células HEK 293 vivas. El análisis cuantitativo de transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia ha revelado que la población de receptores celulares en células que expresan un solo subtipo de mAChR M1, M2 o M3 está compuesta predominantemente por homodímeros de alta afinidad. El análisis de la curva de saturación de las células que expresan dos subtipos de receptores demuestra la existencia de heterodímeros mAChR M1/M2, M2/M3 y M1/M3 de alta afinidad, aunque los valores de afinidad relativa fueron ligeramente inferiores a los de los homodímeros mAChR. El tratamiento con agonistas a corto plazo no modificó el estado oligomérico de los homodímeros y heterodímeros. Cuando se expresa en células JEG-3, el receptor M2 exhibe una susceptibilidad mucho mayor que el receptor M3 a la regulación negativa inducida por agonistas. La coexpresión de M3 mAChR con cantidades crecientes del subtipo M2 en células JEG-3 dio como resultado una mayor regulación negativa de M3 inducida por agonistas, lo que sugiere un nuevo papel de la heterodimerización en el mecanismo de regulación a largo plazo de mAChR. Durante la última década, muchos estudios han demostrado una amplia evidencia de que los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) 3Las abreviaturas utilizadas son: GPCR, receptor acoplado a la proteína G; mAChR, receptor muscarínico de acetilcolina; TMD, dominio transmembrana; BRET, transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia; RLuc, luciferasa de Renilla; YFP, proteína de fluorescencia amarilla, GFP, proteína de fluorescencia verde; Smo, suavizado; QNB, quinuclidinil bencilato; i3, tercer bucle intracelular; PBS, solución salina tamponada con fosfato; HA, hemaglutinina. interactúan entre sí para formar homo o heterooligómeros constitutivos. La dimerización de GPCR se ha implicado en muchos aspectos de la farmacología del receptor, como la maduración, la unión al ligando, la activación, la señalización, la desensibilización, la endocitosis y el tráfico (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 3Breitwieser G.E. Circ. Res. 2004; 94: 17-27Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). A principios de la década de 1990, varios estudios mostraron que los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR), al igual que otros GPCR, podrían estar dispuestos en complejos diméricos u oligoméricos. Las curvas de unión complejas para agonistas y antagonistas muscarínicos se interpretaron como evidencia de la existencia de múltiples estados de afinidad, lo que es consistente con la noción de sitios de unión ubicados en moléculas receptoras diméricas (4Hirschberg B.T. Schimerlik M.I. J. Biol. Chem. 1994; 269: 26127-26135Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 5Potter L.T. Ballesteros L.A. Bichajian L.H. Ferrendelli C.A. Fisher A. Hanchett H.E. Zhang R. Mol. Pharmacol. 1991; 39: 211-221PubMed Google Scholar). Estudios más recientes sobre mAChR han demostrado que dicha heterogeneidad de afinidad debería atribuirse más bien a los efectos cooperativos sensibles a los nucleótidos entre los sitios de interacción (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992; 31: 10908-10921Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar, 7Chidiac P.A. Green M.A. Pawagi A.B. Wells J.W. Biochemistry. 1997; 36: 7361-7379Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar). Debido a que parece haber un sitio de unión por molécula receptora, la cooperatividad sugiere que mAChR son en realidad oligómeros formados por dos o más sitios de interacción (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992; 31: 10908-10921 Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar). La evidencia farmacológica adicional de que mAChR puede formar dímeros fue proporcionada por Maggio et al. (8Maggio R. Vogel Z. Wess J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 3103-3107Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar), que utilizó receptores muscarínicos α2-adrenérgicos/M3 quiméricos compuestos por los primeros cinco dominios transmembrana (TMD) de un receptor y los dos últimos TMD del otro. No se detectó unión o señalización cuando cualquiera de las proteínas de fusión se expresó sola, pero la coexpresión de ambas quimeras rescató la actividad de unión y las propiedades de señalización de los ligandos adrenérgicos y muscarínicos. Estos resultados se interpretaron como interacciones intermoleculares entre dos receptores inactivos que ahora participan en un complejo dimérico con propiedades funcionales del receptor restauradas. Sin embargo, dichos resultados de transcomplementación se han cuestionado debido al hecho de que esas interacciones intermoleculares se observaron estudiando receptores mutantes y no receptores de tipo salvaje (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). La coinmunoprecipitación de mAChR M3 marcado con epítopo solubilizado y el análisis de transferencia Western también se han empleado para demostrar la existencia de oligómeros de mAChR de forma directa. Este enfoque bioquímico reveló que el mAChR M3 es capaz de formar dímeros/multímeros unidos por disulfuro, así como no covalentes (9Zeng F.Y. Wess J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 19487-19497Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (215) Google Scholar). Aunque los ensayos de coinmunoprecipitación/inmunotransferencia proporcionan pruebas bastante convincentes de la formación de dímeros de mAChR, dichos estudios han sido criticados por la posibilidad de que la agregación de receptores observada podría ser el resultado de un artefacto debido a la presencia de preparaciones concentradas de moléculas altamente hidrófobas después del proceso de solubilización (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). Durante la última década, varios grupos han utilizado ensayos biofísicos basados en la transferencia de energía de resonancia de luz para evaluar la oligomerización de GPCR (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar, 11Angers S. Salahpour A. Joly E. Hilairet S. Chelsky D. Dennis M. Bouvier M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 3684-3689PubMed Google Scholar). La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y su variación, la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), se han utilizado ampliamente para superar las limitaciones tecnológicas presentes en los métodos farmacológicos y bioquímicos porque tienen la clara ventaja de monitorear las interacciones en tiempo real entre las proteínas sintetizadas en su ubicación correcta en las células vivas (10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar). En la metodología clásica de BRET, la primera proteína se fusiona con la luciferasa de Renilla (RLuc), y el segundo compañero de proteína se fusiona con una proteína fluorescente (proteína fluorescente amarilla (YFP)). Si ambos socios interactúan, la transferencia de energía de resonancia entre RLuc (donante) y el YFP (aceptor) se puede medir tras la adición del sustrato RLuc coelenterazina (12Xu Y. Piston D.W. Johnson C.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 151-156Crossref PubMed Scopus (507) Google Scholar). En este estudio, BRET investigó la aparición de homo y heterooligómeros constitutivos entre mAChR M1, M2 y M3 en células vivas que expresan niveles fisiológicos de estos receptores. Se realizaron experimentos de saturación de BRET para estimar la capacidad relativa de cada subtipo de receptor para participar en interacciones homo y heterotrópicas. También se abordaron la naturaleza de dichos homooligómeros, la proporción de moléculas receptoras que forman esos complejos oligoméricos y el efecto del agonista muscarínico en la homo y heterodimerización de mAChR M1, M2 y M3. Finalmente, examinamos las implicaciones de la oligomerización en la función de mAChR determinando el efecto de la heterodimerización de M2/M3 en la regulación de mAChR de M3 inducida por agonistas. Materiales: el bencilato de [3H] quinuclidinilo ([3H]QNB, 42 Ci/mmol) y la N-[3H]metilscopolamina (81 Ci/mmol) se adquirieron de Amersham Biosciences. El medio de Eagle modificado por Dulbecco, la penicilina/estreptomicina y el suero fetal bovino se adquirieron en Invitrogen. Las enzimas de restricción eran de New England Biolabs (Beverly, MA), y la coelenterazina h se obtuvo de Promega (Madison, WI). El anticuerpo policlonal anti-HA (HA.11) se adquirió de Covance (Berkeley, CA). El cloruro de carbamilcolina (carbacol), el sulfato de atropina, el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 y todos los demás reactivos se adquirieron de Sigma. El anticuerpo monoclonal contra el mAChR cardíaco porcino M2 fue generado y caracterizado por Luetje et al. (13Luetje C.W. Brumwell C. Norman M.G. Peterson G.L. Schimerlik M.I. Nathanson N.M. Biochemistry. 1987; 26: 6892-6896 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Constructos de receptor: las proteínas de fusión mAChR-RLuc y mAChR-YFP se construyeron ligando la luciferasa de Renilla (RLuc) y los restos de YFP al extremo C-terminal de los receptores. Las secuencias codificantes de mAChR de M1 de ratón, M2 porcino y M3 humano sin sus codones de terminación se amplificaron mediante el uso de cebadores sentido y antisentido que albergan sitios de restricción únicos. Luego, los fragmentos se subclonaron dentro del marco en pRL-CMV-RLuc (Promega) o pEYFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA). Los sitios de restricción utilizados fueron los siguientes: XhoI/BamHI (M1-RLuc, M1-YFP), XhoI/SacII (M2-RLuc, M2-YFP), EcoRV/BamHI (M3-RLuc) y EcoRI/BamHI (M3-YFP). pEYFP se cortó con AgeI y BsrGI, y el fragmento YFP se insertó en el sitio AgeI/BsrGI de Smoothened-GFP humano (Smo-GFP) para dar Smo-YFP. Smo-GFP fue proporcionado por el Dr. A. Kaykas (Universidad de Washington). El plásmido de expresión HA-M3 mAChR se obtuvo del Centro de Recursos de ADNc de la Universidad de Missouri-Rolla (Rolla, MO). Todas las demás construcciones se han descrito en otra parte (14Nadler L.S. Kumar G. Nathanson N.M.J. Biol. Chem. 2001; 276: 10539-10547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar, 15Kaykas A. Yang-Snyder J. Héroux M. Shah K.V. Bouvier M. Moon R.T. Nat. Cell Biol. 2004; 6: 52-58Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). Cultivo y transfección celular: se cultivaron células HEK 293 o JEG-3 en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10% (v/v) y penicilina (100 unidades/ml)/sulfato de estreptomicina (0,1 mg/ml) a 37 °C en un entorno humidificado con 10% de CO2. Las transfecciones transitorias se realizaron en células que estaban en una confluencia del 70-80% usando el protocolo de precipitación con fosfato de calcio (16Mellon P. Parker V. Gluzman Y. Maniatis T. Cell. 1981; 27: 279-288Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (335) Google Scholar). Caracterización farmacológica de constructos: las células HEK 293 cultivadas en placas de 15 cm se transfectaron con mAChR etiquetado con RLuc, etiquetado con YFP o no etiquetado (12.5-25 μg de ADN/placa). Después de un período de 36 h después de la transfección, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y se obtuvieron membranas como se describió anteriormente (17Goin J.C. Nathanson N.M.J. Neurochem. 2002; 83: 964-972 Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar). Los estudios de unión por saturación se realizaron incubando membranas con concentraciones crecientes de [3H]QNB a 37 °C durante 90 min en fosfato de sodio/potasio 50 mm, pH 7,4. Se utilizó atropina (1 μm) para definir la unión inespecífica. La reacción se detuvo mediante filtración rápida sobre filtros de fibra de vidrio GF/C (Whatman). A continuación, los filtros se lavaron cuatro veces con tampón de fosfato frío y se determinó la radiactividad retenida mediante recuento de centelleo. Las curvas se analizaron mediante análisis de regresión no lineal utilizando el software Prism 4 (GraphPad, San Diego). Ensayos BRET: treinta y seis horas después de la transfección, las células HEK 293 se distribuyeron en microplacas de 96 pocillos (isoplaca opaca blanca, Wallac) lavadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en PBS/glucosa al 0,1% en presencia o ausencia de 10 μm de carbacol a 25 °C. Se añadió coelenterazina h a una concentración final de 5 μm, y la intensidad de la luz se integró secuencialmente en las ventanas de 510–590 y 440–500 nm utilizando un lector de múltiples placas Victor2 (PerkinElmer Life Sciences). La relación de BRET se definió como ((emisión a 510–590)/(emisión a 440–500)) – Cf, donde Cf correspondía a (emisión a 510–590)/(emisión a 440–500) para las construcciones de receptor RLuc expresadas solas en los mismos experimentos. Mediciones de fluorescencia y luminiscencia: se recolectaron células HEK 293 transfectadas de forma transitoria, se lavaron y se resuspendieron como se describió anteriormente y luego se distribuyeron en microplacas de 96 pocillos (isoplacas opacas de fondo transparente o blancas para determinaciones de fluorescencia y luminiscencia, respectivamente). Ambas determinaciones también se llevaron a cabo en un lector multiplaca Victor2. La fluorescencia total de las células se midió utilizando un filtro de excitación de 485 nm y un filtro de emisión de 535 nm. Para evaluar la actividad de la luciferasa de Renilla, se determinó la luminiscencia total en muestras incubadas con 5 μm de coelenterazina. Para ambas mediciones, se calcularon las medias de los pocillos duplicados. Los valores de fluorescencia totales se dividieron luego por el fondo determinado en pocillos que contenían células no transfectadas. Los valores de fondo para la luminiscencia total fueron insignificantes y se restaron de los valores de la muestra. Titulación de proteínas de fusión donantes y aceptoras: los niveles de expresión de las construcciones mAChR-RLuc y mAChR-YFP se controlaron midiendo la luminiscencia y la fluorescencia, respectivamente, como se describió anteriormente. Este procedimiento se basa en observar que se ha encontrado que los niveles de luminiscencia y fluorescencia de varias proteínas de fusión receptor-RLuc y receptor-YFP (o receptor-GFP) se correlacionan linealmente con los números de receptores (18Ayoub M.A. Levoye A. Delagrange P. Jockers R. Mol. Pharmacol. 2004; 66: 312-321Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). Debido a que esta correlación es una propiedad intrínseca de cada proteína de fusión, probamos si nuestras proteínas de fusión mAChR seguían un patrón de correlación lineal. Por lo tanto, expresamos cada mAChR-RLuc o mAChR-YFP a diferentes niveles en células HEK 293 y evaluamos la relación entre la actividad de luciferasa o fluorescencia, respectivamente, y la cantidad de sitios de unión a mAChR en las mismas células. Treinta y seis horas después de la transfección, se incubaron ~20.000 células HEK 293 con [3H]QNB 1 nm en PBS, glucosa al 0,1% durante 90 min a 25 °C. La unión no específica se determinó en presencia de 1 μm de atropina. La reacción se detuvo mediante filtración rápida sobre filtros de fibra de vidrio GF/C, que luego se lavaron cuatro veces con PBS frío. La radiactividad retenida se determinó como se describió anteriormente. La luminiscencia y la fluorescencia (unidades arbitrarias) se graficaron contra los sitios de unión totales, y se obtuvieron curvas de regresión lineal (Fig. 2). Estas curvas estándar generadas para cada experimento individual se utilizaron para transformar los valores de fluorescencia y luminiscencia en femtomoles de receptor. Por lo tanto, las relaciones fluorescencia/luminiscencia se transformaron en relaciones (receptor-YFP)/(receptor-RLuc), lo que nos permitió determinar los valores precisos de BRETmax y BRET50 (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Se determinó la concentración de proteína de las muestras para controlar el número de células y también para expresar el número de receptores en femtomoles/mg de proteína celular total, utilizando el método estándar descrito por Lowry et al. (20 Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. Randall R.J. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Ensayos de regulación negativa del receptor: la determinación de la regulación negativa de mAChR M2 o M3 inducida por agonistas se logró utilizando la unión del ligando muscarínico permeable a la membrana [3H]QNB a células intactas que expresan cualquiera de los subtipos DE mAChR, como se describió anteriormente (21Schlador M.L. Grubbs R.D. Nathanson N.M.J. Biol. Chem. 2000; 275: 23295-23302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (33) Google Scholar). En resumen, las células JEG-3 se transfectaron transitoriamente con construcciones de ADN de mAChR M2 o FLAG-M3. Cuarenta y ocho horas después, las células se incubaron con carbacol 1 mm durante diferentes tiempos (dentro de un intervalo de 0-12 h) o en presencia de diversas concentraciones de carbacol durante 12 h a 37 °C. Las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y se marcaron con una concentración de saturación de [3H]QNB (~1 nm) en PBS durante 90 min a 37 °C. La unión no específica se determinó en presencia de 1 μm de atropina. Las células marcadas se lavaron con PBS enfriado con hielo y se filtraron en filtros de membrana GF/C (Whatman). A continuación, los filtros se lavaron con PBS enfriado con hielo, se transfirieron a viales de centelleo y se combinaron con fluido de centelleo antes de la determinación de la radiactividad mediante recuento de centelleo. La regulación negativa de las células mAChR-JEG-3 M2 y M3 coexpresadas se transfectó con mAChR M2, mAChR FLAG-M3 o ambas construcciones de ADN en diferentes proporciones siguiendo el procedimiento indicado anteriormente. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se trataron con carbacol de 10 μm durante 12 h a 37 °C. Luego, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo, se cosecharon en amortiguador de fosfato de sodio/potasio 50 mm, pH 7.4, complementado con inhibidores de proteasa (10 μg/ml de leupeptina, 70 μg/ml de fluoruro de fenilmetanosulfonilo y 0.25 μg/ml de pepstatina A), y se homogeneizaron con vidrio y vidrio. Las membranas se obtuvieron como se describió anteriormente (17Goin J.C. Nathanson N.M.J. Neurochem. 2002; 83: 964-972 Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar), y el número total de mAChR en homogeneizados de membrana brutos se determinó usando la unión de [3H]QNB como describen Halvorsen y Nathanson (22Halvorsen S.W. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1981; 256: 7941-7948Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Los números de mAChR M2 y FLAG-M3 se midieron mediante el ensayo DE inmunoprecipitación descrito anteriormente (23McKinnon L.A. Nathanson N.M.J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar) utilizando anticuerpos monoclonales anti-M2 y anti-FLAG, respectivamente. Alternativamente, los experimentos de control se realizaron mediante la cotransfección de células con mAChR FLAG-M3 y mAChR HA-M3 a diferentes niveles DE expresión relativa, según lo determinado por inmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-FLAG y anti-HA (23McKinnon L.A. Nathanson N.M.J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar). El grado de regulación negativa de FLAG-M3 después del tratamiento con carbacol se determinó como se indicó anteriormente. Análisis de datos: se analizaron las curvas de saturación bret utilizando el software Prism 4. Las isotermas se ajustaron utilizando una ecuación de regresión no lineal suponiendo un único sitio de unión, que proporcionó los valores BRETmax y BRET50. La correlación entre la fluorescencia o luminiscencia y la densidad del receptor se analizó mediante el ajuste de la curva de regresión lineal con el mismo software. La significación estadística de las diferencias en la regulación de mAChR de M2 frente a M3 se evaluó mediante la prueba t de Student no apareada de dos colas. La homo y heterodimerización de mAChR M1, M2 y M3 se evaluaron en células HEK 293 vivas mediante análisis BRET cuantitativo. Para este propósito, los tres subtipos de mAChR se fusionaron en su extremo C al donante de energía RLuc o al aceptor YFP. Para garantizar que las proteínas de fusión expresadas fueran polipéptidos plegados adecuadamente capaces de unirse a ligandos muscarínicos, evaluamos sus propiedades de unión mediante ensayos de unión por saturación utilizando el antagonista muscarínico [3H]QNB. El análisis detallado de los valores de Kd obtenidos de esas curvas de saturación (Tabla 1) indicó que las modificaciones en el extremo C de mAChR M1, M2 y M3 no alteraron significativamente la afinidad por el radioligando muscarínico en comparación con los receptores de tipo salvaje. En otro conjunto de experimentos, todas las construcciones se expresaron individualmente en células HEK 293, y la unión del ligando muscarínico impermeable a la membrana N-[3H]metilescopolamina se determinó en paralelo con la unión del antagonista muscarínico permeable a la membrana [3H]QNB a concentraciones de radioligando saturantes para cada receptor expresado. Debido a que no se encontraron diferencias significativas entre los niveles de unión de ambos radioligandos al mismo receptor, 4J. C. Goin y N. M. Nathanson, observaciones no publicadas. concluimos que todas las proteínas de fusión se expresan en la superficie celular y que dicha colocalización garantiza sus posibilidades de interactuar entre sí.TABLE 1Parámetros de unión de los constructos mAChR M1, M2 y M3ConstructKdpmM1 mAChR-RLuc13.7 ± 0.9M1 mAChR-YFP13.0 ± 0.7WT-M1 mAChR11.7 ± 2.0M2 mAChR-RLuc19.4 ± 2.0M2 mAChR-YFP24.6 ± 3.3WT-M2 mAChR24.0 ± 2.8M3 mAChR-RLuc38.6 ± 3.2M3 mAChR-YFP33.6 ± 4.2WT-M3 mAChR37.8 ± 2.5 Tabla abierta en una nueva pestaña Para determinar si M1, M2 y M3 mAChR pueden formar homodímeros en células intactas, evaluamos la capacidad de mAChR etiquetado con RLuc coexpresado y mAChR etiquetado con YFP para interactuar entre sí mediante el análisis de la curva de saturación de BRET. Las células HEK 293 se cotransfectaron transitoriamente con una cantidad constante de la construcción RLuc y cantidades crecientes de la construcción YFP, y la transferencia de energía entre ambas proteínas de fusión se midió tras la adición del sustrato de luciferasa de Renilla coelenterazina h. Los niveles de expresión de cada receptor etiquetado con RLuc se evaluaron mediante la detección de la luminiscencia total de la reacción de luciferasa previa, y los niveles de expresión de los receptores etiquetados con YFP se controlaron mediante la determinación de la fluorescencia total. Debido a que se encontró que los niveles de expresión de las construcciones de RLuc se modificaban mediante la cotransfección de cantidades crecientes de sus compañeros de YFP, las señales de BRET se graficaron en función de la relación fluorescencia/luminiscencia. La coexpresión de moléculas donantes M1, M2 o M3 con sus compañeros aceptores homólogos dio como resultado isotermas de saturación clásicas (Fig. 1, A–C), en el que las señales de BRET aumentaron como una función hiperbólica de la concentración del aceptor, alcanzando una asíntota que corresponde a la saturación de todos los donantes de BRET por moléculas aceptoras. Esta constatación sugiere que mAChR M1, M2 y M3 forman homodímeros constitutivos en células vivas. Para garantizar que estas señales de BRET no resultaran de una interacción espuria entre RLuc e YFP, realizamos ensayos de control en los que cada mAChR etiquetado con RLuc se coexpresó con cantidades crecientes de YFP soluble. Estos ensayos de saturación dieron como resultado curvas casi lineales que muestran señales marginales de BRET, lo que indica una interacción inespecífica entre ambos compañeros coexpresados en cada caso. La selectividad de la interacción entre mAChR donante y aceptor se evaluó adicionalmente para descartar la posibilidad de señales BRET inespecíficas debido a la sobreexpresión de proteínas transmembrana. El receptor de señalización de siete transmembranas distantemente relacionado Smoothened fusionado a YFP (Smo-YFP) se cotransfectó con mAChR-RLuc M1, M2 o M3, lo que dio como resultado una relación de BRET drásticamente disminuida para los tres mAChR probados. Por el contrario, la coexpresión de Smo-RLuc con cantidades crecientes de Smo-YFP produjo niveles de BRET significativamente más altos (Fig. 1 complementaria), lo que indica que Smo-RLuc es efectivamente capaz de formar dímeros constitutivos en células intactas cuando se coexpresa con un compañero específico. Los datos de BRET no se vieron influenciados por la posición relativa de RLuc o YFP en los pares de receptores porque se obtuvieron resultados idénticos para la orientación recíproca. 4J. C. Goin y N. M. Nathanson, inéditos. Estos datos confirman nuestra observación anterior, lo que indica que las proteínas de fusión donantes y aceptoras M1, M2 y M3 participan en interacciones específicas como homodímeros constitutivos. Aunque las curvas de saturación mostradas anteriormente sugieren que el donante y aceptor M1, M2 y M3 interactúan específicamente entre sí, no proporcionan suficiente información sobre los parámetros de unión necesarios para el análisis cuantitativo adecuado de las interacciones receptor-receptor. Por lo tanto, realizamos un nuevo conjunto de experimentos de saturación en los que se controló la cantidad de cada receptor expresado eficazmente en las células transfectadas, para cada experimento individual, correlacionando tanto la luminiscencia total como la fluorescencia total con el número de sitios de unión a [3H] QNB. El análisis de dicha correlación muestra una relación lineal entre la luminiscencia total y la densidad del receptor sin diferencias significativas entre las pendientes obtenidas para los tres subtipos de receptores mAChR (Fig. 2). El análisis de correlación entre la fluorescencia total y el número total de receptores también produjo curvas lineales. Sin embargo, la pendiente obtenida para M1-YFP fue significativamente mayor que la de M2-YFP o M3-YFP. Las ecuaciones de regresión lineal que se muestran en la Fig. 2 complementaria se utilizaron para transformar las unidades de fluorescencia y luminiscencia en números de receptores, y las señales de BRET se graficaron en función de la relación (número de receptor-YFP)/(número de receptor-RLuc). Estas nuevas curvas de saturación de BRET también se comportaron como funciones hiperbólicas alcanzando un nivel de saturación (Fig. 2). De acuerdo con el análisis clásico de la interacción proteína-proteína monitorizada por bret suponiendo un sitio de unión, la concentración del aceptor que proporciona el 50% de la transferencia de energía (BRET50) representa la afinidad relativa entre ambos protómeros que interactúan, y la señal máxima de BRET depende del número total de dímeros formados, así como de la distancia entre el donante y el aceptor dentro del dímero (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Al comparar las curvas obtenidas para los homodímeros de mAChR M1, M2 y M3 (Tabla 2), no se encontraron diferencias significativas en los valores de BRET50, lo que indica que las afinidades de los protómeros entre sí son similares entre los tres subtipos de mAChR estudiados. Por otro lado, se encontró que el valor de BRETmax para el par donante-aceptor M1 era significativamente diferente del de los homodímeros M2 y M3. De hecho, el BRETmax para el par M1-RLuc/M1-YFP fue más del doble que los otros valores de BRETmax. Esto podría indicar que un mayor porcentaje del subtipo M1 participa en la homodimerización o que la transferencia de energía entre RLuc y YFP dentro del homodímero M1 es más eficiente que la de los homodímeros M2 y M3. Debido a que se encontró que las afinidades relativas entre cada uno de los socios eran muy similares entre los tres subtipos de receptores (Tabla 2), la segunda hipótesis es más probable. Además, el hecho de que las curvas de correlación entre la fluorescencia total y la densidad del receptor produjeran un valor de pendiente más alto para M1 sugiere que YFP funciona como un aceptor más eficiente cuando se fusiona con el subtipo de receptor M1, lo que puede resultar en valores de BRET más altos para este par.TABLE 2Homodimerización de M1, M2 y M3 mAChR; parámetros de las curvas de saturación de BretPair transfectadoBRETmaxBRET50% de los receptores existentes como dímerosM1-RLuc/M1-YFP0.285 ± 0.0071.83 ± 0.1472 ± 4M2-RLuc/M2-YFP0.139 ± 0.0041.70 ± 0.2378 ± 8M3-RLuc/M3-YFP0.128 ± 0.0031.41 ± 0.1383 ± 6 Tabla abierta en una nueva pestaña Para evaluar la naturaleza de los homo-oligómeros de M1, M2 y M3 mAChR (24Veatch W. Stryer L. Mol. Biol. 1977; 113: 89-102Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar). Esta fórmula describe la probabilidad de formar complejos competentes para bret en función del tamaño oligomérico del receptor (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Las curvas experimentales se ajustan mejor a la curva teórica predicha para un dímero en lugar de las esperadas para un trímero o tetrámero, lo que sugiere que la fracción oligomérica de las poblaciones de mAChR M1, M2 o M3 está compuesta predominantemente por complejos diméricos (Fig. 3). Análisis cuantitativo detallado de la homodimerización del receptor β2-adrenérgico por Mercier et al. (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar) sugirieron que es posible estimar la proporción de receptores involucrados en la dimerización. Suponiendo un equilibrio libre entre las proteínas de fusión donante y aceptor, se espera que solo el 50% de los dímeros generen BRET si ambas parejas se expresan a concentraciones equimolares, porque cada pareja también puede generar un 25% de homodímeros entre moléculas idénticas. Although previous pharmacological and biochemical data support the notion that muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) form homo- and heterodimers, the existence of mAChR oligomers in live cells is still a matter of controversy. Here we used bioluminescence resonance energy transfer to demonstrate that M1, M2, and M3 mAChR can form constitutive homo- and heterodimers in living HEK 293 cells. Quantitative bioluminescence resonance energy transfer analysis has revealed that the cell receptor population in cells expressing a single subtype of M1, M2, or M3 mAChR is predominantly composed of high affinity homodimers. Saturation curve analysis of cells expressing two receptor subtypes demonstrates the existence of high affinity M1/M2, M2/M3, and M1/M3 mAChR heterodimers, although the relative affinity values were slightly lower than those for mAChR homodimers. Short term agonist treatment did not modify the oligomeric status of homo- and heterodimers. When expressed in JEG-3 cells, the M2 receptor exhibits much higher susceptibility than the M3 receptor to agonist-induced down-regulation. Coexpression of M3 mAChR with increasing amounts of the M2 subtype in JEG-3 cells resulted in an increased agonist-induced down-regulation of M3, suggesting a novel role of heterodimerization in the mechanism of mAChR long term regulation. Although previous pharmacological and biochemical data support the notion that muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) form homo- and heterodimers, the existence of mAChR oligomers in live cells is still a matter of controversy. Here we used bioluminescence resonance energy transfer to demonstrate that M1, M2, and M3 mAChR can form constitutive homo- and heterodimers in living HEK 293 cells. Quantitative bioluminescence resonance energy transfer analysis has revealed that the cell receptor population in cells expressing a single subtype of M1, M2, or M3 mAChR is predominantly composed of high affinity homodimers. Saturation curve analysis of cells expressing two receptor subtypes demonstrates the existence of high affinity M1/M2, M2/M3, and M1/M3 mAChR heterodimers, although the relative affinity values were slightly lower than those for mAChR homodimers. Short term agonist treatment did not modify the oligomeric status of homo- and heterodimers. When expressed in JEG-3 cells, the M2 receptor exhibits much higher susceptibility than the M3 receptor to agonist-induced down-regulation. Coexpression of M3 mAChR with increasing amounts of the M2 subtype in JEG-3 cells resulted in an increased agonist-induced down-regulation of M3, suggesting a novel role of heterodimerization in the mechanism of mAChR long term regulation. Over the last decade, many studies have shown broad evidence that G protein-coupled receptors (GPCR) 3The abbreviations used are: GPCR, G protein-coupled receptor; mAChR, muscarinic acetylcholine receptor; TMD, transmembrane domain; BRET, bioluminescence resonance energy transfer; RLuc, Renilla luciferase; YFP, yellow fluorescence protein, GFP, green fluorescence protein; Smo, smoothened; QNB, quinuclidinyl benzilate; i3, third intracellular loop; PBS, phosphate-buffered saline; HA, hemagglutinin. interact with one another to form constitutive homo- or hetero-oligomers. GPCR dimerization has been implicated in many aspects of receptor pharmacology, such as maturation, ligand binding, activation, signaling, desensitization, endocytosis, and trafficking (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 3Breitwieser G.E. Circ. Res. 2004; 94: 17-27Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). In the early 1990s, several studies showed that muscarinic acetylcholine receptors (mAChR), like other GPCR, might be arranged in dimeric or oligomeric complexes. Complex binding curves for both muscarinic agonists and antagonists were interpreted as evidence for the existence of multiple states of affinity, which is consistent with the notion of binding sites located on dimeric receptor molecules (4Hirschberg B.T. Schimerlik M.I. J. Biol. Chem. 1994; 269: 26127-26135Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 5Potter L.T. Ballesteros L.A. Bichajian L.H. Ferrendelli C.A. Fisher A. Hanchett H.E. Zhang R. Mol. Pharmacol. 1991; 39: 211-221PubMed Google Scholar). More recent studies on mAChR have shown that such heterogeneity of affinity should rather be attributed to nucleotide-sensitive cooperative effects between interacting sites (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992; 31: 10908-10921Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar, 7Chidiac P. Green M.A. Pawagi A.B. Wells J.W. Biochemistry. 1997; 36: 7361-7379Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar). Because there seems to be one binding site per receptor molecule, cooperativity suggests that mAChR are actually oligomers formed by two or more interacting sites (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992; 31: 10908-10921Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar). Additional pharmacological evidence that mAChR can form dimers was provided by Maggio et al. (8Maggio R. Vogel Z. Wess J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 3103-3107Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar), who used chimeric α2-adrenergic/M3 muscarinic receptors composed of the first five transmembrane domains (TMD) of one receptor and the last two TMD of the other. No binding or signaling was detected when either fusion protein was expressed alone, but coexpression of both chimeras rescued binding activity and signaling properties of both adrenergic and muscarinic ligands. These results were interpreted as intermolecular interactions between two inactive receptors now engaged in a dimeric complex with restored receptor functional properties. However, such trans-complementation results have been challenged because of the fact that those intermolecular interactions were seen by studying mutant receptors and not wild type receptors (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). Coimmunoprecipitation of solubilized epitope-tagged M3 mAChR and Western blot analysis has also been employed to demonstrate the existence of mAChR oligomers in a direct fashion. This biochemical approach revealed that the M3 mAChR is capable of forming disulfide-linked as well as noncovalent dimers/multimers (9Zeng F.Y. Wess J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 19487-19497Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (215) Google Scholar). Although coimmunoprecipitation/immunoblotting assays provide fairly convincing evidence for mAChR dimer formation, such studies have been criticized for the possibility that the observed receptor aggregation could result from an artifact because of the presence of concentrated preparations of highly hydrophobic molecules following the solubilization process (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). Over the last decade, several groups have used biophysical assays based on light resonance energy transfer to assess GPCR oligomerization (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar, 11Angers S. Salahpour A. Joly E. Hilairet S. Chelsky D. Dennis M. Bouvier M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 3684-3689PubMed Google Scholar). Fluorescence resonance energy transfer and its variation, bioluminescence resonance energy transfer (BRET), have been used extensively to overcome technological limitations present in pharmacological and biochemical methods because they have the distinct advantage of monitoring real time interactions between proteins synthesized in their correct location in living cells (10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar). In the classical BRET methodology, the first protein is fused to Renilla luciferase (RLuc), and the second protein partner is fused to a fluorescent protein (yellow fluorescent protein (YFP)). If both partners interact, resonance energy transfer between RLuc (donor) and the YFP (acceptor) can be measured upon addition of the RLuc substrate coelenterazine (12Xu Y. Piston D.W. Johnson C.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 151-156Crossref PubMed Scopus (507) Google Scholar). In this study, the occurrence of constitutive homo- and hetero-oligomers among M1, M2, and M3 mAChR was investigated in living cells expressing physiological levels of these receptors by BRET. BRET saturation experiments were conducted to estimate the relative ability of each receptor subtype to engage in homo- and heterotropic interactions. The nature of such homo-oligomers, the proportion of receptor molecules forming those oligomeric complexes, and the effect of muscarinic agonist on M1, M2, and M3 mAChR homo- and heterodimerization were also addressed. Finally, we examined the implications of oligomerization on mAChR function by determining the effect of M2/M3 heterodimerization on agonist-induced M3 mAChR regulation. Materials—[3H]Quinuclidinyl benzilate ([3H]QNB, 42 Ci/mmol) and N-[3H]methylscopolamine (81 Ci/mmol) were purchased from Amersham Biosciences. Dulbecco's modified Eagle's medium, penicillin/streptomycin, and fetal bovine serum were purchased from Invitrogen. Restriction enzymes were from New England Biolabs (Beverly, MA), and coelenterazine h was obtained from Promega (Madison, WI). The anti-HA polyclonal antibody (HA.11) was purchased from Covance (Berkeley, CA). Carbamylcholine chloride (carbachol), atropine sulfate, anti-FLAG M2 monoclonal antibody, and all other reagents were purchased from Sigma. The monoclonal antibody against the porcine cardiac M2 mAChR was generated and characterized by Luetje et al. (13Luetje C.W. Brumwell C. Norman M.G. Peterson G.L. Schimerlik M.I. Nathanson N.M. Biochemistry. 1987; 26: 6892-6896Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Receptor Constructs—mAChR-RLuc and mAChR-YFP fusion proteins were constructed by ligating the Renilla luciferase (RLuc) and the YFP moieties to the C-terminal end of the receptors. Mouse M1, porcine M2, and human M3 mAChR coding sequences without their stop codons were amplified by using sense and antisense primers harboring unique restriction sites. The fragments were then subcloned in-frame into pRL-CMV-RLuc (Promega) or pEYFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA). Restriction sites used were as follows: XhoI/BamHI (M1-RLuc, M1-YFP), XhoI/SacII (M2-RLuc, M2-YFP), EcoRV/BamHI (M3-RLuc), and EcoRI/BamHI (M3-YFP). pEYFP was cut with AgeI and BsrGI, and the YFP fragment was inserted into the AgeI/BsrGI site from human Smoothened-GFP (Smo-GFP) to give Smo-YFP. Smo-GFP was provided by Dr. A. Kaykas (University of Washington). The HA-M3 mAChR expression plasmid was obtained from University of Missouri-Rolla cDNA Resource Center (Rolla, MO). All other constructs have been described elsewhere (14Nadler L.S. Kumar G. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 2001; 276: 10539-10547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar, 15Kaykas A. Yang-Snyder J. Héroux M. Shah K.V. Bouvier M. Moon R.T. Nat. Cell Biol. 2004; 6: 52-58Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). Cell Culture and Transfection—HEK 293 or JEG-3 cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum and penicillin (100 units/ml)/streptomycin sulfate (0.1 mg/ml) at 37 °C in a humidified 10% CO2 environment. Transient transfections were performed on cells that were at 70–80% confluence using the calcium phosphate precipitation protocol (16Mellon P. Parker V. Gluzman Y. Maniatis T. Cell. 1981; 27: 279-288Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (335) Google Scholar). Pharmacological Characterization of Constructs—HEK 293 cells grown in 15-cm dishes were transfected with RLuc-tagged, YFP-tagged, or nontagged mAChR (12.5-25 μg of DNA/plate). Following a 36-h period post-transfection, cells were washed with ice-cold PBS, and membranes were obtained as described previously (17Goin J.C. Nathanson N.M. J. Neurochem. 2002; 83: 964-972Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar). Saturation binding studies were performed by incubating membranes with increasing concentrations of [3H]QNB at 37 °C for 90 min in 50 mm sodium/potassium phosphate, pH 7.4. Atropine (1 μm) was used to define nonspecific binding. The reaction was stopped by rapid filtration over GF/C glass-fiber filters (Whatman). Filters were then washed four times with cold phosphate buffer, and the retained radioactivity was determined by scintillation counting. Curves were analyzed by nonlinear regression analysis using Prism 4 software (GraphPad, San Diego). BRET Assays—Thirty six hours after transfection, HEK 293 cells were distributed in 96-well microplates (white opaque Isoplate, Wallac) washed with phosphate-buffered saline (PBS) and resuspended in PBS/glucose 0.1% in the presence or absence of 10 μm carbachol at 25 °C. Coelenterazine h was added at a final concentration of 5 μm, and light intensity was sequentially integrated in the 510–590 and 440–500 nm windows using a Victor2 multiplate reader (PerkinElmer Life Sciences). BRET ratio was defined as ((emission at 510–590)/(emission at 440–500)) – Cf, where Cf corresponded to (emission at 510–590)/(emission at 440–500) for the receptor RLuc constructs expressed alone in the same experiments. Fluorescence and Luminescence Measurements—Transiently transfected HEK 293 cells were harvested, washed, and resuspended as described above and then distributed in 96-well microplates (either clear-bottomed or white opaque Isoplates for fluorescence and luminescence determinations, respectively). Both determinations were also carried out in a Victor2 multiplate reader. The total fluorescence of cells was measured using an excitation filter of 485 nm and an emission filter of 535 nm. For assessing the activity of Renilla luciferase, total luminescence was determined on samples incubated with 5 μm coelenterazine. For both measurements, the means of duplicate wells were calculated. Total fluorescence values were then divided by the background determined in wells containing untransfected cells. The background values for total luminescence were negligible, and they were subtracted from sample values. Titration of Donor and Acceptor Fusion Proteins—Expression levels of mAChR-RLuc and mAChR-YFP constructs were monitored by measuring luminescence and fluorescence, respectively, as described above. This procedure is based on the observation that luminescence and fluorescence levels of several receptor-RLuc and receptor-YFP (or receptor-GFP) fusion proteins have been found to be linearly correlated with receptor numbers (18Ayoub M.A. Levoye A. Delagrange P. Jockers R. Mol. Pharmacol. 2004; 66: 312-321Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). Because this correlation is an intrinsic property of each fusion protein, we tested whether our mAChR fusion proteins followed a linear correlation pattern. Thus, we expressed each mAChR-RLuc or mAChR-YFP at different levels in HEK 293 cells and assessed the relationship between luciferase activity or fluorescence, respectively, and the amount of mAChR-binding sites in the same cells. Thirty six hours after transfection, ∼20,000 HEK 293 cells were incubated with 1 nm [3H]QNB in PBS, 0.1% glucose for 90 min at 25 °C. Nonspecific binding was determined in the presence of 1 μm atropine. The reaction was stopped by rapid filtration over GF/C glass-fiber filters, which were then washed four times with cold PBS. Retained radioactivity was determined as described above. Luminescence and fluorescence (arbitrary units) were plotted against total binding sites, and linear regression curves were obtained (supplemental Fig. 2). These standard curves generated for each single experiment were used to transform fluorescence and luminescence values into femtomoles of receptor. Thus, the fluorescence/luminescence ratios were transformed into (receptor-YFP)/(receptor-RLuc) ratios, which allowed us to determine accurate BRETmax and BRET50 values (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Protein concentration of samples was determined to control for the number of cells and also to express receptor numbers in femtomole/mg of total cell protein, using the standard method described by Lowry et al. (20Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. Randall R.J. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Receptor Down-regulation Assays—Determination of agonist-induced M2 or M3 mAChR down-regulation was accomplished using the binding of the membrane-permeable muscarinic ligand [3H]QNB to intact cells expressing either mAChR subtype, as described previously (21Schlador M.L. Grubbs R.D. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 2000; 275: 23295-23302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (33) Google Scholar). Briefly, JEG-3 cells were transiently transfected with either M2 or FLAG-M3 mAChR DNA constructs. Forty eight hours later cells were incubated either with 1 mm carbachol for different times (within a 0–12-h-range) or in the presence of various concentrations of carbachol for 12 h at 37 °C. Cells were then washed with ice-cold PBS and labeled with a saturating concentration of [3H]QNB (∼1 nm) in PBS for 90 min at 37 °C. Nonspecific binding was determined in the presence of 1 μm atropine. Labeled cells were washed with ice-cold PBS and filtered onto GF/C membrane filters (Whatman). Filters were then washed with ice-cold PBS, transferred to scintillation vials, and combined with scintillation fluid before the determination of radioactivity by scintillation counting. Down-regulation of Coexpressed M2 and M3 mAChR—JEG-3 cells were transfected with M2 mAChR, FLAG-M3 mAChR, or both DNA constructs at different proportions following the procedure indicated above. Forty eight hours post-transfection, cells were treated with 10 μm carbachol for 12 h at 37 °C. Cells were then washed with ice-cold PBS, harvested in 50 mm sodium/potassium phosphate buffer, pH 7.4, supplemented with protease inhibitors (10 μg/ml leupeptin, 70 μg/ml phenylmethanesulfonyl fluoride, and 0.25 μg/ml pepstatin A), and were glass-glass homogenized. Membranes were obtained as described previously (17Goin J.C. Nathanson N.M. J. Neurochem. 2002; 83: 964-972Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar), and the total number of mAChR in crude membrane homogenates was determined using the binding of [3H]QNB as described by Halvorsen and Nathanson (22Halvorsen S.W. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1981; 256: 7941-7948Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The numbers of M2 and FLAG-M3 mAChR were measured by the immunoprecipitation assay described previously (23McKinnon L.A. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar) using anti-M2 and anti-FLAG monoclonal antibodies, respectively. Alternatively, control experiments were performed by cotransfecting cells with FLAG-M3 mAChR and HA-M3 mAChR at different relative expression levels, as determined by immunoprecipitation using anti-FLAG and anti-HA antibodies (23McKinnon L.A. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar). The extent of FLAG-M3 down-regulation after carbachol treatment was then determined as indicated above. Data Analysis—BRET saturation curves were analyzed using Prism 4 software. Isotherms were fitted using a nonlinear regression equation assuming a single binding site, which provided BRETmax and BRET50 values. The correlation between fluorescence or luminescence and receptor density was analyzed by linear regression curve fitting with the same software. Statistical significance of differences in M2 versus M3 mAChR regulation was assessed by the two-tailed unpaired Student's t test. Homo- and heterodimerization of M1, M2, and M3 mAChR were assessed in live HEK 293 cells by quantitative BRET analysis. For this purpose, the three mAChR subtypes were fused at their C terminus to the energy donor RLuc or the acceptor YFP. To ensure that the expressed fusion proteins were properly folded polypeptides capable of binding muscarinic ligands, we assessed their binding properties by saturation binding assays using the muscarinic antagonist [3H]QNB. Detailed analysis of the Kd values obtained from those saturation curves (Table 1) indicated that the modifications at the C terminus of M1, M2, and M3 mAChR did not significantly alter the affinity for the muscarinic radioligand as compared with the wild type receptors. In another set of experiments, all constructs were individually expressed in HEK 293 cells, and the binding of the membrane-impermeable muscarinic ligand N-[3H]methylscopolamine was determined in parallel with the binding of the membrane-permeable muscarinic antagonist [3H]QNB at saturating radioligand concentrations for each receptor expressed. Because no significant difference was found between the binding levels of both radioligands to the same receptor, 4J. C. Goin and N. M. Nathanson, unpublished observations. we concluded that all fusion proteins are expressed at the cell surface and that such colocalization ensures their chances of interacting with each other.TABLE 1Binding parameters of M1, M2, and M3 mAChR constructsConstructKdpmM1 mAChR-RLuc13.7 ± 0.9M1 mAChR-YFP13.0 ± 0.7WT-M1 mAChR11.7 ± 2.0M2 mAChR-RLuc19.4 ± 2.0M2 mAChR-YFP24.6 ± 3.3WT-M2 mAChR24.0 ± 2.8M3 mAChR-RLuc38.6 ± 3.2M3 mAChR-YFP33.6 ± 4.2WT-M3 mAChR37.8 ± 2.5 Open table in a new tab To determine whether M1, M2, and M3 mAChR can form homodimers in intact cells, we assessed the ability of coexpressed RLuc-tagged mAChR and YFP-tagged mAChR to interact with one another by BRET saturation curve analysis. HEK 293 cells were transiently cotransfected with a constant amount of the RLuc construct and increasing amounts of the YFP construct, and the transfer of energy between both fusion proteins was measured upon addition of the Renilla luciferase substrate coelenterazine h. The expression levels of each RLuc-tagged receptor were assessed by detection of total luminescence from the previous luciferase reaction, and the expression levels of the YFP-tagged receptors were monitored by determination of total fluorescence. Because the expression levels of RLuc constructs were found to be modified by the cotransfection of increasing amounts of their YFP partners, BRET signals were plotted as a function of the fluorescence/luminescence ratio. Coexpression of M1, M2, or M3 donor molecules with their homologous acceptor partners resulted in classical saturation isotherms (Fig. 1, A–C), in which BRET signals increased as a hyperbolic function of the concentration of the acceptor, reaching an asymptote that corresponds to the saturation of all BRET donors by acceptor molecules. This observation suggests that M1, M2, and M3 mAChR form constitutive homodimers in live cells. To ensure that these BRET signals did not result from a spurious interaction between RLuc and YFP, we performed control assays in which each RLuc-tagged mAChR was coexpressed with increasing amounts of soluble YFP. These saturation assays resulted in quasi-linear curves showing marginal BRET signals, which indicate a nonspecific interaction between both coexpressed partners in each case. The selectivity of the interaction between donor and acceptor mAChR was further assessed to rule out the possibility of nonspecific BRET signals because of transmembrane protein overexpression. The distantly related seven transmembrane signaling receptor Smoothened fused to YFP (Smo-YFP) was cotransfected with M1, M2, or M3 mAChR-RLuc, which resulted in a dramatically decreased BRET ratio for the three mAChR tested. In contrast, coexpression of Smo-RLuc with increasing amounts of Smo-YFP yielded significantly higher BRET levels (supplemental Fig. 1), indicating that Smo-RLuc is effectively capable of forming constitutive dimers in intact cells when coexpressed with a specific partner. BRET data were not influenced by the relative position of RLuc or YFP on the receptor pairs because identical results were obtained for the reciprocal orientation. 4J. C. Goin and N. M. Nathanson, unpublished observations. These data confirm our previous observation, indicating that M1, M2, and M3 donor and acceptor fusion proteins are engaged in specific interactions as constitutive homodimers. Although the saturation curves shown previously suggest that M1, M2, and M3 donor and acceptor specifically interact with each other, they do not provide enough information about the binding parameters required for proper quantitative analysis of receptor-receptor interactions. Therefore, we conducted a new set of saturation experiments in which the amount of each receptor effectively expressed in transfected cells was monitored, for each individual experiment, by correlating both total luminescence and total fluorescence with the number of [3H]QNB-binding sites. The analysis of such correlation shows a linear relationship between total luminescence and receptor density with no significant differences among the slopes obtained for the three mAChR receptor subtypes (supplemental Fig. 2). Correlation analysis between total fluorescence and total receptor numbers also yielded linear curves. However, the slope obtained for M1-YFP was significantly higher than that from either M2-YFP or M3-YFP. The linear regression equations shown in supplemental Fig. 2 were used to transform fluorescence and luminescence units to receptor numbers, and BRET signals were plotted as a function of (receptor-YFP number)/(receptor-RLuc number) ratio. These new BRET saturation curves also behaved as hyperbolic functions reaching a saturation level (Fig. 2). According to classical analysis of BRET-monitored protein-protein interaction assuming one binding site, the concentration of the acceptor giving 50% of the energy transfer (BRET50) accounts for the relative affinity between both interacting protomers, and the maximal BRET signal depends on the total number of dimers formed as well as on the distance between the donor and the acceptor within the dimer (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). When comparing the curves obtained for M1, M2, and M3 mAChR homodimers (Table 2), no significant differences in BRET50 values were found, indicating that the affinities of protomers for one another are similar among the three mAChR subtypes studied. On the other hand the BRETmax value for the M1 donor-acceptor pair was found to be significantly different from that for M2 and M3 homodimers. Indeed, the BRETmax for the M1-RLuc/M1-YFP pair was over twice as high as the other BRETmax values. This could indicate that either a higher percentage of the M1 subtype is engaged in homodimerization or that energy transfer between RLuc and YFP within the M1 homodimer is more efficient than that for M2 and M3 homodimers. Because the relative affinities between each of the partners were found to be very similar among the three receptor subtypes (Table 2), the second hypothesis is more likely. Moreover, the fact that correlation curves between total fluorescence and receptor density yielded a higher slope value for M1 suggests that YFP functions as a more efficient acceptor when it is fused to the M1 receptor subtype, which may result in higher BRET values for this pair.TABLE 2Homodimerization of M1, M2, and M3 mAChR; parameters from BRET saturation curvesPair transfectedBRETmaxBRET50% of receptors existing as dimersM1-RLuc/M1-YFP0.285 ± 0.0071.83 ± 0.1472 ± 4M2-RLuc/M2-YFP0.139 ± 0.0041.70 ± 0.2378 ± 8M3-RLuc/M3-YFP0.128 ± 0.0031.41 ± 0.1383 ± 6 Open table in a new tab To assess the nature of M1, M2, and M3 mAChR homo-oligomers, we compared their corresponding experimental saturation curves (Fig. 2) with the expected ones for dimeric, trimeric, and tetrameric complexes using a modification of the equation by Veatch and Stryer (24Veatch W. Stryer L. J. Mol. Biol. 1977; 113: 89-102Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar). This formula describes the probability of forming BRET-competent complexes as a function of the oligomeric size of the receptor (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). The experimental curves fit better to the theoretical curve predicted for a dimer rather than those expected for a trimer or tetramer, suggesting that the oligomeric fraction of M1, M2, or M3 mAChR populations is predominantly composed of dimeric complexes (Fig. 3). Detailed quantitative analysis of β2-adrenergic receptor homodimerization by Mercier et al. (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar) suggested that it is possible to estimate the proportion of receptors engaged in dimerization. Assuming a free equilibrium between donor and acceptor fusion proteins, only 50% of the dimers are expected to generate BRET if both partners are expressed at equimolar concentrations, because each partner can also generate 25% homodimers between identical molecules. على الرغم من أن البيانات الدوائية والكيميائية الحيوية السابقة تدعم فكرة أن مستقبلات أسيتيل كولين المسكارينية (mAChR) تشكل متجانسات وغير متجانسة، إلا أن وجود أوليغومرات mAChR في الخلايا الحية لا يزال موضع جدل. استخدمنا هنا نقل طاقة رنين التلألؤ الحيوي لإثبات أن M1 و M2 و M3 mAChR يمكن أن تشكل مثبطات متجانسة وغير متجانسة في خلايا HEK الحية 293. كشف تحليل نقل طاقة الرنين الحيوي الكمي أن مجموعة مستقبلات الخلايا في الخلايا التي تعبر عن نوع فرعي واحد من M1 أو M2 أو M3 mAChR تتكون في الغالب من متجانسات تقارب عالية. يوضح تحليل منحنى التشبع للخلايا التي تعبر عن نوعين فرعيين من المستقبلات وجود متغايرات M1/M2 و M2/M3 و M1/M3 mAChR عالية التقارب، على الرغم من أن قيم التقارب النسبية كانت أقل قليلاً من قيم المتجانسات mAChR. لم يغير العلاج الناهض قصير المدى حالة القلة المتجانسة وغير المتجانسة. عند التعبير عنه في خلايا JEG -3، يُظهر مستقبل M2 قابلية أعلى بكثير من مستقبل M3 للتنظيم السفلي المستحث بالمواد المساعدة. أدى التعبير المشترك عن M3 mAChR مع كميات متزايدة من النوع الفرعي M2 في خلايا JEG -3 إلى زيادة التنظيم السفلي المستحث بالمواد المساعدة لـ M3، مما يشير إلى دور جديد للثنائية غير المتجانسة في آلية التنظيم طويل المدى لـ mAChR. على الرغم من أن البيانات الدوائية والكيميائية الحيوية السابقة تدعم فكرة أن مستقبلات أسيتيل كولين المسكارينية (mAChR) تشكل متجانسات وغير متجانسة، إلا أن وجود أوليغومرات mAChR في الخلايا الحية لا يزال موضع جدل. استخدمنا هنا نقل طاقة رنين التلألؤ الحيوي لإثبات أن M1 و M2 و M3 mAChR يمكن أن تشكل مثبطات متجانسة وغير متجانسة في خلايا HEK الحية 293. كشف تحليل نقل طاقة الرنين الحيوي الكمي أن مجموعة مستقبلات الخلايا في الخلايا التي تعبر عن نوع فرعي واحد من M1 أو M2 أو M3 mAChR تتكون في الغالب من متجانسات تقارب عالية. يوضح تحليل منحنى التشبع للخلايا التي تعبر عن نوعين فرعيين من المستقبلات وجود متغايرات M1/M2 و M2/M3 و M1/M3 mAChR عالية التقارب، على الرغم من أن قيم التقارب النسبية كانت أقل قليلاً من قيم المتجانسات mAChR. لم يغير العلاج الناهض قصير المدى حالة القلة المتجانسة وغير المتجانسة. عند التعبير عنه في خلايا JEG -3، يُظهر مستقبل M2 قابلية أعلى بكثير من مستقبل M3 للتنظيم السفلي المستحث بالمواد المساعدة. أدى التعبير المشترك عن M3 mAChR مع كميات متزايدة من النوع الفرعي M2 في خلايا JEG -3 إلى زيادة التنظيم السفلي المستحث بالمواد المساعدة لـ M3، مما يشير إلى دور جديد للثنائية غير المتجانسة في آلية التنظيم طويل المدى لـ mAChR. على مدى العقد الماضي، أظهرت العديد من الدراسات أدلة واسعة على أن مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCR) 3 الاختصارات المستخدمة هي: GPCR، مستقبل G المقترنة بالبروتين ؛ mAChR، مستقبل أسيتيل كولين المسكاريني ؛ TMD، المجال عبر الغشاء ؛ BRET، نقل طاقة رنين التلألؤ الحيوي ؛ RLuc، Renilla luciferase ؛ YFP، بروتين مضان أصفر، GFP، بروتين مضان أخضر ؛ Smo، smoothened ؛ QNB، quinuclidinyl benzilate ؛ i3، الحلقة الثالثة داخل الخلايا ؛ PBS، محلول ملحي مخفف بالفوسفات ؛ HA، هيماجلوتينين. تتفاعل مع بعضها البعض لتشكيل أقطاب متجانس أو غير متجانس. وقد تورطت ثنائية GPCR في العديد من جوانب علم الأدوية المستقبلة، مثل النضج، وربط الرابطة، والتنشيط، والإشارات، وإزالة الحساسية، والإلتقام، والاتجار (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286 Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435 Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 3Breitwieser G.E. Circ. Res. 2004; 94: 17-27 Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). في أوائل التسعينيات، أظهرت العديد من الدراسات أن مستقبلات أسيتيل كولين المسكارينية (mAChR)، مثل GPCR الأخرى، قد يتم ترتيبها في مجمعات ثنائية أو قليلة القسيمات. تم تفسير منحنيات الربط المعقدة لكل من ناهضات المسكارين والمضادات كدليل على وجود حالات متعددة من التقارب، والتي تتفق مع مفهوم مواقع الربط الموجودة على جزيئات المستقبلات الثنائية (4Hirschberg B.T. Schimerlik M.I. J. Biol. Chem. 1994; 269: 26127-26135Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 5Potter L.T. Ballesteros L.A. Bichajian L.H. Ferrendelli C.A. Fisher A. Hanchett H.E. Zhang R. Mol. Pharmacol. 1991 ؛ 39: 211-221 PubMed الباحث العلمي من Google). أظهرت الدراسات الحديثة حول mAChR أن مثل هذا التباين في التقارب يجب أن يُعزى بدلاً من ذلك إلى التأثيرات التعاونية الحساسة للنيوكليوتيدات بين المواقع المتفاعلة (6Chidiac P. Wells JW Biochemistry. 1992 ؛ 31: 10908-10921 Crossref PubMed Scopus (39) الباحث العلمي من Google، 7Chidiac P. Green M.A. Pawagi AB Wells JW Biochemistry. 1997 ؛ 36: 7361-7379 Crossref PubMed Scopus (96) الباحث العلمي من Google). نظرًا لأنه يبدو أن هناك موقع ربط واحد لكل جزيء مستقبل، فإن التعاون يشير إلى أن mAChR هي في الواقع أوليغومرات تتكون من موقعين متفاعلين أو أكثر (6Chidiac P. Wells JW Biochemistry. 1992 ؛ 31: 10908-10921 Crossref PubMed Scopus (39) الباحث العلمي من Google). تم تقديم أدلة دوائية إضافية على أن mAChR يمكن أن يشكل dimers بواسطة Maggio et al. (8Maggio R. Vogel Z. Wess J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993 ؛ 90: 3103-3107 Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar)، الذي استخدم مستقبلات مسكارينية خيالية α 2 - adrenergic/M3 تتكون من المجالات الخمسة الأولى عبر الغشاء (TMD) لمستقبل واحد وآخر اثنين من TMD من الآخر. لم يتم الكشف عن أي ارتباط أو إشارة عند التعبير عن أي من بروتينات الاندماج بمفردها، ولكن التعبير المشترك لكل من الكميرات أنقذ نشاط الارتباط وخصائص الإشارة لكل من الروابط الأدرينالية والمسكارينية. تم تفسير هذه النتائج على أنها تفاعلات بين الجزيئات بين مستقبلين غير نشطين ينخرطان الآن في مركب ثنائي الأبعاد مع خصائص وظيفية للمستقبلات المستعادة. ومع ذلك، فقد تم تحدي نتائج التكامل هذه بسبب حقيقة أن هذه التفاعلات بين الجزيئات شوهدت من خلال دراسة مستقبلات الطفرة وليس مستقبلات النوع البري (1Bouvier M. Nat. مراجعة Neurosci. 2001 ؛ 2: 274-286 Crossref PubMed Scopus (582) الباحث العلمي من Google). كما تم استخدام الترسيب المشترك للحاتمة الموسومة M3 mAChR وتحليل البقعة الغربية لإثبات وجود أوليغومرات mAChR بطريقة مباشرة. كشف هذا النهج الكيميائي الحيوي أن M3 mAChR قادر على تكوين ثنائيات الكبريتيد المرتبطة وكذلك ثنائيات/متعددة التكافؤ (9Zeng FY Wess JJ Biol. كيم. 1999 ؛ 274: 19487-19497 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (215) الباحث العلمي من Google). على الرغم من أن فحوصات الترسيب المناعي/التكتل المناعي تقدم دليلًا مقنعًا إلى حد ما على تكوين دايمر mAChR، فقد تم انتقاد مثل هذه الدراسات لاحتمال أن يكون تراكم المستقبلات المرصود ناتجًا عن قطعة أثرية بسبب وجود مستحضرات مركزة لجزيئات مسعور للغاية بعد عملية الذوبان (1Bouvier M. Nat. مراجعة Neurosci. 2001 ؛ 2: 274-286 Crossref PubMed Scopus (582) الباحث العلمي من Google). على مدى العقد الماضي، استخدمت عدة مجموعات المقايسات الفيزيائية الحيوية بناءً على نقل طاقة رنين الضوء لتقييم تقزيم GPCR (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286 Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435 Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004; 24: 254-278 Crossref Scopus (84) Google Scholar, 11Angers S. Salahpour A. Joly E. Hilairet S. Chelsky D. Dennis M. Bouvier M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000 ؛ 97: 3684-3689 PubMed Google Scholar). تم استخدام نقل طاقة رنين الفلورة وتغيرها، نقل طاقة رنين التألق الحيوي (BRET)، على نطاق واسع للتغلب على القيود التكنولوجية الموجودة في الطرق الدوائية والكيميائية الحيوية لأنها تتمتع بميزة واضحة تتمثل في مراقبة التفاعلات في الوقت الفعلي بين البروتينات المركبة في موقعها الصحيح في الخلايا الحية (10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004 ؛ 24: 254-278 Crossref Scopus (84) Google Scholar). في منهجية بريت الكلاسيكية، يتم دمج البروتين الأول مع لوسيفيراز رينيلا (RLuc)، ويتم دمج شريك البروتين الثاني مع بروتين فلوري (بروتين فلوري أصفر (YFP)). إذا تفاعل كلا الشريكين، يمكن قياس نقل طاقة الرنين بين RLuc (المانح) و YFP (المستقبل) عند إضافة RLuc الركيزة coelenterazine (12Xu Y. Piston D.W. Johnson C.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999 ؛ 96: 151-156 Crossref PubMed Scopus (507) Google Scholar). في هذه الدراسة، تم التحقيق في حدوث متجانسات متجانسة وغير متجانسة بين M1 و M2 و M3 mAChR في الخلايا الحية التي تعبر عن المستويات الفسيولوجية لهذه المستقبلات بواسطة بريت. أجريت تجارب تشبع بريت لتقدير القدرة النسبية لكل نوع فرعي من المستقبلات على الانخراط في تفاعلات متجانسة وغير متجانسة. كما تم تناول طبيعة هذه المتجانسات، ونسبة جزيئات المستقبلات التي تشكل تلك المجمعات القلة، وتأثير ناهض المسكارين على M1 و M2 و M3 mAChR homo - و heterodimerization. أخيرًا، درسنا آثار القلة على وظيفة mAChR من خلال تحديد تأثير M2/M3 heterodimerization على تنظيم M3 mAChR المستحث بالمواد المساعدة. المواد - [3H] تم شراء Quinuclidinyl benzilate ([3H]QNB، 42 Ci/mmol) و N -[3H] methylscopolamine (81 Ci/mmol) من Amersham Biosciences. تم شراء وسيط Eagle المعدل من Dulbecco، البنسلين/الستربتومايسين، ومصل الأبقار الجنيني من Invitrogen. كانت إنزيمات التقييد من مختبرات نيو إنجلاند الحيوية (بيفرلي، ماساتشوستس)، وتم الحصول على كولينتيرازين h من بروميجا (ماديسون، ويسكونسن). تم شراء الجسم المضاد متعدد النسائل المضاد لـ HA (HA.11) من كوفانس (بيركلي، كاليفورنيا). تم شراء كلوريد الكرباميل كولين (كرباكول)، وكبريتات الأتروبين، والجسم المضاد أحادي النسيلة M2 المضاد لـ FLAG، وجميع الكواشف الأخرى من Sigma. تم إنشاء الجسم المضاد أحادي النسيلة ضد M2 mAChR القلبي للخنازير وتميز به Luetje et al. (13Luetje C.W. Brumwell C. Norman M.G. Peterson G.L. Schimerlik M.I. Nathanson N.M. الكيمياء الحيوية. 1987 ؛ 26: 6892-6896 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). تم بناء بروتينات الانصهار mAChR - RLuc و mAChR - YFP عن طريق ربط رينيلا لوسيفيراز (RLuc) وشظايا YFP بالطرف C من المستقبلات. تم تضخيم تسلسلات ترميز mAChR للفأر M1 والخنزير M2 والبشر M3 بدون رموز التوقف الخاصة بهم باستخدام المواد التمهيدية الحساسة والمضادة للإحساس التي تحتوي على مواقع تقييد فريدة. ثم تم استنساخ الشظايا في الإطار الفرعي إلى pRL - CMV - RLuc (Promega) أو pEYFP - N1 (Clontech، Palo Alto، CA). كانت مواقع التقييد المستخدمة على النحو التالي: XhoI/BamHI (M1 - RLuc، M1 - YFP)، XhoI/SacII (M2 - RLuc، M2 - YFP)، EcoRV/BamHI (M3 - RLuc)، و EcoRI/BamHI (M3 - YFP). تم قطع pEYFP مع AgeI و BsrGI، وتم إدخال جزء YFP في موقع AgeI/BsrGI من Smo - GFP البشري (Smo - GFP) لإعطاء Smo - YFP. تم توفير Smo - GFP من قبل الدكتور أ. كايكاس (جامعة واشنطن). تم الحصول على بلازميد تعبير HA - M3 mAChR من مركز موارد الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين بجامعة ميسوري- رولا (رولا، ميزوري). تم وصف جميع التركيبات الأخرى في مكان آخر (14Nadler LS Kumar G. Nathanson NM J. Biol. Chem. 2001; 276: 10539-10547 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar, 15Kaykas A. Yang - Snder J. Héroux M. Shah K.V. Bouvier M. Moon R.T.Nat. Cell Biol. 2004; 6: 52-58 Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). زراعة الخلايا وانتقالها - نمت خلايا HeK 293 أو JEG -3 في وسط النسر المعدل في دولبيكو مع 10 ٪ (حجم/حجم) من مصل الأبقار الجنيني والبنسلين (100 وحدة/مل)/ستربتومايسين سلفات (0.1 ملغ/مل) عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة بنسبة 10 ٪ من ثاني أكسيد الكربون. تم إجراء عمليات نقل عابرة على الخلايا التي كانت عند التقاء 70-80 ٪ باستخدام بروتوكول ترسيب فوسفات الكالسيوم (16Mellon P. Parker V. Gluzman Y. Maniatis T. Cell. 1981 ؛ 27: 279-288 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (335) الباحث العلمي من Google). التوصيف الدوائي للبنيات - تم نقل 293 خلية نمت في أطباق 15 سم مع RLuc - tagged، YFP - tagged، أو غير الموسومة mAChR (12.5-25 ميكروغرام من الحمض النووي/لوحة). بعد فترة 36 ساعة بعد العدوى، تم غسل الخلايا بـ PBS المثلج، وتم الحصول على الأغشية كما هو موضح سابقًا (17Goin JC Nathanson NMJ Neurochem. 2002 ؛ 83: 964-972 Crossref PubMed Scopus (9) الباحث العلمي من Google). تم إجراء دراسات ربط التشبع عن طريق احتضان الأغشية بتركيزات متزايدة من [3H]QNB عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في 50 مم من فوسفات الصوديوم/البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4. تم استخدام الأتروبين (1 ميكرومتر) لتحديد الارتباط غير المحدد. تم إيقاف التفاعل عن طريق الترشيح السريع فوق مرشحات الألياف الزجاجية GF/C (Whatman). ثم تم غسل المرشحات أربع مرات باستخدام عازل الفوسفات البارد، وتم تحديد النشاط الإشعاعي المحتفظ به عن طريق عد الوميض. تم تحليل المنحنيات من خلال تحليل الانحدار غير الخطي باستخدام برنامج Prism 4 (GraphPad، San Diego). فحوصات بريت - بعد ست وثلاثين ساعة من انتقال العدوى، تم توزيع خلايا HEK 293 في ألواح دقيقة مكونة من 96 بئرًا (إيزوبليت أبيض معتم، والاك) مغسولة بمحلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) وأعيد تعليقها في PBS/جلوكوز 0.1 ٪ في وجود أو عدم وجود 10 ميكرومتر من الكرباكول عند 25 درجة مئوية. تمت إضافة Coelenterazine h بتركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر، وتم دمج شدة الضوء بالتتابع في النوافذ 510–590 و 440–500 نانومتر باستخدام قارئ Victor2 المضاعف (PerkinElmer Life Sciences). تم تعريف نسبة بريت على أنها ((انبعاث عند 510-590)/(انبعاث عند 440–500)) – راجع، حيث يتوافق Cf مع (انبعاث عند 510-590)/(انبعاث عند 440–500) لبنيات مستقبلات RLuc المعبر عنها بمفردها في نفس التجارب. قياسات التألق والتألق - تم حصاد خلايا HEK 293 المصابة مؤقتًا وغسلها وإعادة تعليقها كما هو موضح أعلاه ثم توزيعها في ألواح دقيقة بسعة 96 بئرًا (إما ذات قاع شفاف أو بيضاء معتمة لتحديد التألق والتألق، على التوالي). تم تنفيذ كلا القرارين أيضًا في قارئ فيكتور 2 المضاعف. تم قياس الفلورة الكلية للخلايا باستخدام مرشح استثارة قدره 485 نانومتر ومرشح انبعاث قدره 535 نانومتر. لتقييم نشاط رينيلا لوسيفيراز، تم تحديد التألق الكلي على العينات المحتضنة بـ 5 ميكرومتر من الكويلينتيرازين. بالنسبة لكلا القياسين، تم حساب وسائل الآبار المكررة. ثم قسمت قيم الفلورة الإجمالية على الخلفية المحددة في الآبار التي تحتوي على خلايا غير منقولة. كانت قيم الخلفية للتلألؤ الكلي ضئيلة، وتم طرحها من قيم العينة. تمت مراقبة معايرة بروتينات الانصهار المانحة والمقبولة - مستويات التعبير عن بنيات mAChR - RLuc و mAChR - YFP عن طريق قياس التألق والتألق، على التوالي، كما هو موضح أعلاه. يعتمد هذا الإجراء على ملاحظة أن مستويات التألق والفلورة للعديد من بروتينات اندماج مستقبلات RLuc ومستقبلات YFP (أو مستقبلات GFP) قد وجد أنها مرتبطة خطيًا بأرقام المستقبلات (18Ayoub MA Levoye A. Delagrange P. Jockers R. Mol. Pharmacol. 2004; 66: 312-321 Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). نظرًا لأن هذا الارتباط هو خاصية جوهرية لكل بروتين اندماجي، فقد اختبرنا ما إذا كانت بروتينات اندماج mAChR تتبع نمط ارتباط خطي. وهكذا، عبرنا عن كل mAChR - RLuc أو mAChR - YFP على مستويات مختلفة في خلايا HEK 293 وقمنا بتقييم العلاقة بين نشاط اللوسيفراز أو الفلورة، على التوالي، وكمية مواقع ربط mAChR في نفس الخلايا. بعد ست وثلاثين ساعة من نقل العدوى، تم تحضين 20000 خلية HEK 293 مع 1 نانومتر [3H]QNB في PBS، 0.1 ٪ جلوكوز لمدة 90 دقيقة عند 25 درجة مئوية. تم تحديد الارتباط غير المحدد في وجود أتروبين 1 ميكرومتر. تم إيقاف التفاعل عن طريق الترشيح السريع على مرشحات الألياف الزجاجية GF/C، والتي تم غسلها بعد ذلك أربع مرات باستخدام PBS البارد. تم تحديد النشاط الإشعاعي المحتجز كما هو موضح أعلاه. تم رسم اللمعان والفلورة (الوحدات العشوائية) مقابل مواقع الربط الإجمالية، وتم الحصول على منحنيات الانحدار الخطي (الشكل التكميلي. 2). تم استخدام هذه المنحنيات القياسية التي تم إنشاؤها لكل تجربة واحدة لتحويل قيم التألق والتألق إلى فيمتومولات مستقبلات. وهكذا، تم تحويل نسب التألق/التلألؤ إلى نسب (مستقبل- YFP)/(مستقبل- RLuc)، مما سمح لنا بتحديد قيم BRETmax و BRET50 الدقيقة (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. كيم. 2002 ؛ 277: 44925-44931 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (422) الباحث العلمي من Google). تم تحديد تركيز البروتين للعينات للتحكم في عدد الخلايا وأيضًا للتعبير عن أرقام المستقبلات في الفيمتومول/ملغ من إجمالي بروتين الخلية، باستخدام الطريقة القياسية التي وصفها لوري وآخرون. (20 Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. Randall R.J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275 Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). فحوصات تنظيم خفض المستقبلات - تم تحديد تنظيم خفض M2 أو M3 mAChR المستحث بالمؤثرات باستخدام ربط الرباط المسكاريني المنفذ للغشاء [3H]QNB بالخلايا السليمة التي تعبر عن النوع الفرعي mAChR، كما هو موضح سابقًا (21Schlador M.L. Grubbs R.D. Nathanson N.M. J. Biol. كيم. 2000 ؛ 275: 23295-23302 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (33) الباحث العلمي من Google). باختصار، تم نقل خلايا JEG -3 بشكل عابر إما باستخدام بنيات الحمض النووي M2 أو FLAG - M3 mAChR. بعد ثمان وأربعين ساعة تم تحضين الخلايا إما بكرباكول 1 مم لأوقات مختلفة (ضمن نطاق 0-12 - h) أو في وجود تركيزات مختلفة من الكرباكول لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم تم غسل الخلايا بـ PBS المثلج وتم تصنيفها بتركيز مشبع قدره [3H]QNB (1 نانومتر) في PBS لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم تحديد الارتباط غير المحدد في وجود أتروبين 1 ميكرومتر. تم غسل الخلايا الملصقة بالجليد البارد PBS وترشيحها على مرشحات غشاء GF/C (Whatman). ثم تم غسل المرشحات باستخدام PBS البارد، ونقلها إلى قوارير التلألؤ، ودمجها مع سائل التلألؤ قبل تحديد النشاط الإشعاعي عن طريق عد التلألؤ. تم نقل تنظيم خلايا M2 و M3 mAChR - JEG -3 المعبر عنها مع M2 mAChR أو FLAG - M3 mAChR أو كل من تركيبات الحمض النووي بنسب مختلفة باتباع الإجراء المشار إليه أعلاه. بعد ثمان وأربعين ساعة من العدوى، عولجت الخلايا بكرباكول 10 ميكرومتر لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم تم غسل الخلايا باستخدام PBS المثلج، وتم حصادها في محلول صوديوم/فوسفات البوتاسيوم 50 مم، ودرجة الحموضة 7.4، واستكملت بمثبطات الأنزيم البروتيني (10 ميكروغرام/مل من اللوبيبتين، و 70 ميكروغرام/مل من فلوريد فينيل ميثان سلفونيل، و 0.25 ميكروغرام/مل من بيبستاتين أ)، وتم تجنيس الزجاج. تم الحصول على الأغشية كما هو موضح سابقًا (17Goin JC Nathanson NMJ Neurochem. 2002 ؛ 83: 964-972 Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar)، وتم تحديد العدد الإجمالي لـ mAChR في متجانسات الغشاء الخام باستخدام ربط [3H]QNB كما وصفه Halvorsen و Nathanson (22Halvorsen S.W. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1981; 256: 7941-7948 Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). تم قياس أعداد M2 و FLAG - M3 mAChR بواسطة اختبار الترسيب المناعي الموصوف سابقًا (23McKinnon L.A. Nathanson N.M.J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar) باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ M2 و FLAG، على التوالي. بدلاً من ذلك، تم إجراء تجارب التحكم بواسطة خلايا نقل مشتركة مع FLAG - M3 mAChR و HA - M3 mAChR عند مستويات تعبير نسبي مختلفة، على النحو الذي يحدده الترسيب المناعي باستخدام الأجسام المضادة لـ FLAG والأجسام المضادة لـ HA (23McKinnon L.A. Nathanson n.M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar). ثم تم تحديد مدى انخفاض تنظيم FLAG - M3 بعد علاج الكرباكول كما هو موضح أعلاه. تحليل البيانات - تم تحليل منحنيات تشبع BRET باستخدام برنامج Prism 4. تم تركيب متساوي الحرارة باستخدام معادلة انحدار غير خطية بافتراض موقع ربط واحد، والذي قدم قيم BRETmax و BRET50. تم تحليل العلاقة بين التألق أو التألق وكثافة المستقبلات من خلال منحنى الانحدار الخطي المناسب مع نفس البرنامج. تم تقييم الأهمية الإحصائية للاختلافات في تنظيم M2 مقابل M3 mAChR من خلال اختبار t غير المقترن ثنائي الذيل للطالب. تم تقييم المضاعفة المتجانسة وغير المتجانسة لـ M1 و M2 و M3 mAChR في خلايا HEK الحية 293 من خلال تحليل بريت الكمي. لهذا الغرض، تم دمج الأنواع الفرعية الثلاثة لـ mAChR في الطرف C الخاص بها إلى RLuc المانح للطاقة أو YFP المتقبل. للتأكد من أن بروتينات الانصهار المعبر عنها عبارة عن عديد ببتيدات مطوية بشكل صحيح وقادرة على ربط الروابط المسكارينية، قمنا بتقييم خصائص ربطها عن طريق فحوصات ربط التشبع باستخدام مضاد المسكارين [3H]QNB. أشار التحليل التفصيلي لقيم Kd التي تم الحصول عليها من منحنيات التشبع هذه (الجدول 1) إلى أن التعديلات عند الطرف C لـ M1 و M2 و M3 mAChR لم تغير بشكل كبير من تقارب المادة المشعة المسكارينية مقارنة بمستقبلات النوع البري. في مجموعة أخرى من التجارب، تم التعبير عن جميع التركيبات بشكل فردي في خلايا HEK 293، وتم تحديد ارتباط الرابطة المسكارينية غير المنفذة للغشاء N -[3H] ميثيلسكوبولامين بالتوازي مع ربط المضاد المسكاريني المنفذ للغشاء [3H]QNB بتركيزات رابطة إشعاعية مشبعة لكل مستقبل معبر عنه. لأنه لم يتم العثور على فرق كبير بين مستويات الارتباط لكل من الروابط المشعة لنفس المستقبل، 4J. C. Goin و N. M. Nathanson، ملاحظات غير منشورة. خلصنا إلى أن جميع بروتينات الاندماج يتم التعبير عنها على سطح الخلية وأن مثل هذا التوطين يضمن فرصها في التفاعل مع بعضها البعض. TABLE 1 معلمات الربط لـ M1 و M2 و M3 mAChR constructsConstructKdpmM1 mAChR - RLuc13.7 ± 0.9M1 mAChR - YFP13.0 ± 0.7WT-M1 mAChR11.7 ± 2.0M2 mAChR - RLuc19.4 ± 2.0M2 mAChR - YFP24.6 ± 3.3WT-M2 mAChR24.0 ± 2.8M3 mAChR - RLuc38.6 ± 3.2M3 mAChR - YFP33.6 ± 4.2WT-M3 mAChR37.8 ± 2.5 جدول مفتوح في علامة تبويب جديدة لتحديد ما إذا كان بإمكان M1 و M2 و M3 mAChR تشكيل متجانسات في الخلايا السليمة، قمنا بتقييم قدرة mAChR المعبر عنها و YAChR - taghR على التفاعل مع واحد آخر من خلال تحليل منحنى Breturation. تم نقل خلايا HEK 293 بشكل عابر مع كمية ثابتة من بنية RLuc وكميات متزايدة من بنية YFP، وتم قياس نقل الطاقة بين كل من بروتينات الاندماج عند إضافة رينيلا لوسيفيراز الركيزة coelenterazine h. تم تقييم مستويات التعبير لكل مستقبل محدد بعلامة RLuc من خلال الكشف عن التألق الكلي من تفاعل لوسيفيراز السابق، وتمت مراقبة مستويات التعبير للمستقبلات المحددة بعلامة YFP من خلال تحديد التألق الكلي. نظرًا لأنه تم العثور على تعديل مستويات التعبير عن بنيات RLuc من خلال النقل المشترك لكميات متزايدة من شركائهم في YFP، فقد تم رسم إشارات BRET كدالة لنسبة التألق/التلألؤ. أدى التعبير المشترك للجزيئات المانحة M1 أو M2 أو M3 مع شركائها المتقبلين المتماثلين إلى تشبع متساوي الحرارة كلاسيكيًا (الشكل 1، A - C)، حيث زادت إشارات بريت كدالة زائدة لتركيز المستقبل، لتصل إلى خط التقارب الذي يتوافق مع تشبع جميع متبرعي بريت بواسطة جزيئات المستقبل. تشير هذه الملاحظة إلى أن M1 و M2 و M3 mAChR تشكل مثبطات متجانسة تكوينية في الخلايا الحية. للتأكد من أن إشارات BRET هذه لم تنتج عن تفاعل زائف بين RLuc و YFP، أجرينا فحوصات تحكم تم فيها التعبير عن كل mAChR موسوم بـ RLuc بكميات متزايدة من YFP القابلة للذوبان. أدت فحوصات التشبع هذه إلى منحنيات شبه خطية تظهر إشارات بريت هامشية، والتي تشير إلى تفاعل غير محدد بين كلا الشريكين المعبر عنهما في كل حالة. كما تم تقييم انتقائية التفاعل بين المتبرع والمستقبل mAChR لاستبعاد إمكانية إشارات BRET غير المحددة بسبب التعبير المفرط للبروتين عبر الغشاء. تم نقل مستقبلات الإشارات السبعة عبر الغشاء ذات الصلة البعيدة المنصهرة إلى YFP (Smo - YFP) مع M1 أو M2 أو M3 mAChR - RLuc، مما أدى إلى انخفاض كبير في نسبة BRET لثلاثة mAChR تم اختبارها. في المقابل، أدى التعبير المشترك لـ Smo - RLuc مع كميات متزايدة من Smo - YFP إلى مستويات BRET أعلى بكثير (الشكل التكميلي 1)، مما يشير إلى أن Smo - RLuc قادر بشكل فعال على تكوين أبعاد تأسيسية في خلايا سليمة عند التعبير المشترك مع شريك معين. لم تتأثر بيانات بريت بالموقف النسبي لـ RLuc أو YFP على أزواج المستقبلات لأنه تم الحصول على نتائج متطابقة للتوجه المتبادل. 4J. C. Goin and N. M. Nathanson، ملاحظات غير منشورة. تؤكد هذه البيانات ملاحظتنا السابقة، مما يشير إلى أن بروتينات الانصهار المانحة والمتقبلة M1 و M2 و M3 تشارك في تفاعلات محددة كمتجانسات تأسيسية. على الرغم من أن منحنيات التشبع الموضحة سابقًا تشير إلى أن المتبرع والمستقبل M1 و M2 و M3 يتفاعلان على وجه التحديد مع بعضهما البعض، إلا أنهما لا يوفران معلومات كافية حول معلمات الربط المطلوبة للتحليل الكمي المناسب لتفاعلات المستقبلات والمستقبلات. لذلك، أجرينا مجموعة جديدة من تجارب التشبع التي تم فيها مراقبة كمية كل مستقبل معبر عنها بشكل فعال في الخلايا المنقولة بالعدوى، لكل تجربة فردية، من خلال ربط كل من التألق الكلي والفلورة الكلية بعدد [3H] مواقع ربط QNB. يُظهر تحليل هذا الارتباط علاقة خطية بين اللمعان الكلي وكثافة المستقبلات مع عدم وجود اختلافات كبيرة بين المنحدرات التي تم الحصول عليها للأنواع الفرعية الثلاثة لمستقبلات mAChR (الشكل التكميلي. 2). أدى تحليل الارتباط بين الفلورة الإجمالية وأرقام المستقبلات الإجمالية أيضًا إلى منحنيات خطية. ومع ذلك، كان المنحدر الذي تم الحصول عليه لـ M1 - YFP أعلى بكثير من ذلك من M2 - YFP أو M3 - YFP. تم استخدام معادلات الانحدار الخطي الموضحة في الشكل التكميلي 2 لتحويل وحدات التألق والتلألؤ إلى أرقام مستقبلات، وتم رسم إشارات بريت كدالة لنسبة (رقم المستقبل- YFP)/(رقم المستقبل- RLuc). كما تصرفت منحنيات تشبع بريت الجديدة هذه كوظائف زائدة تصل إلى مستوى تشبع (الشكل 2). وفقًا للتحليل الكلاسيكي لتفاعل البروتين والبروتين الخاضع لمراقبة BRET بافتراض موقع ربط واحد، فإن تركيز المستقبل الذي يعطي 50 ٪ من نقل الطاقة (BRET50) يمثل التقارب النسبي بين كل من البروتومرات المتفاعلة، وتعتمد إشارة بريت القصوى على العدد الإجمالي للثنائي المتكون وكذلك على المسافة بين المانح والمقبل داخل الدايمر (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. كيم. 2002 ؛ 277: 44925-44931 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (422) الباحث العلمي من Google). عند مقارنة المنحنيات التي تم الحصول عليها من المتجانسات M1 و M2 و M3 mAChR (الجدول 2)، لم يتم العثور على اختلافات كبيرة في قيم BRET50، مما يشير إلى أن تقارب البروتومرات لبعضها البعض متشابهة بين الأنواع الفرعية الثلاثة mAChR التي تمت دراستها. من ناحية أخرى، وجد أن قيمة BRETmax لزوج مستقبلات المتبرع M1 تختلف اختلافًا كبيرًا عن قيمة M2 و M3 homodimers. في الواقع، كان BRETmax لزوج M1 - RLuc/M1 - YFP أعلى بمرتين من قيم BRETmax الأخرى. يمكن أن يشير هذا إلى أن إما نسبة أعلى من النوع الفرعي M1 تعمل في الميمرة المتجانسة أو أن نقل الطاقة بين RLuc و YFP داخل الميمرة المتجانسة M1 أكثر كفاءة من الميمرات المتجانسة M2 و M3. نظرًا لأن التقارب النسبي بين كل من الشركاء وجد أنه متشابه جدًا بين الأنواع الفرعية الثلاثة للمستقبلات (الجدول 2)، فإن الفرضية الثانية أكثر احتمالًا. علاوة على ذلك، فإن حقيقة أن منحنيات الارتباط بين إجمالي الفلورة وكثافة المستقبل أسفرت عن قيمة انحدار أعلى لـ M1 تشير إلى أن YFP يعمل كمستقبل أكثر كفاءة عندما يندمج مع النوع الفرعي لمستقبل M1، مما قد يؤدي إلى قيم BRET أعلى لهذا الزوج. TABLE 2 تجانس M1 و M2 و M3 mAChR ؛ المعلمات من منحنيات تشبع BretPair transfectedBRETmaxBRET50 ٪ من المستقبلات الموجودة كـ dimersM1 - RLuc/M1-YFP0.285 ± 0.0071.83 ± 0.1472 ± 4M2 - RLuc/M2 - YFP0.139 ± 0.0041.70 ± 0.2378 ± 8M3 - RLuc/M3-YFP0.128 ± 0.0031.41 ± 0.1383 ± 6 جدول مفتوح في علامة تبويب جديدة لتقييم طبيعة M1 و M2 و M3 mAChR - homigolers، قمنا بمقارنة منحنيات التشبع المقابلة لها. (الشكل 2) مع تلك المتوقعة، الأبعاد، ثلاثية الأبعاد، والتعقيدات الثلاثية باستخدام المعادلات من المعادلة بواسطة VeerVry (W. بيول. 1977 ؛ 113: 89-102 Crossref PubMed Scopus (174) الباحث العلمي من Google). تصف هذه الصيغة احتمال تشكيل مجمعات مؤهلة لـ BRET كدالة لحجم القسيمات للمستقبل (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. كيم. 2002 ؛ 277: 44925-44931 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (422) الباحث العلمي من Google). تتناسب المنحنيات التجريبية بشكل أفضل مع المنحنى النظري المتوقع للثنائي بدلاً من تلك المتوقعة للثنائي أو الرباعي، مما يشير إلى أن الجزء الأوليغومري من مجموعات M1 أو M2 أو M3 mAChR يتكون في الغالب من معقدات ثنائية الأبعاد (الشكل 3). تحليل كمي مفصل لمستقبلات المستقبلات الأدرينالية بيتا 2 من قبل مرسييه وآخرون. (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier MJ Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931 اقترح Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar) أنه من الممكن تقدير نسبة المستقبلات المشاركة في ثنائية الأبعاد. بافتراض وجود توازن حر بين بروتينات الانصهار المانحة والمتقبلة، من المتوقع أن يولد 50 ٪ فقط من الدايمرات بريت إذا تم التعبير عن كلا الشريكين بتركيزات متساوية، لأن كل شريك يمكنه أيضًا توليد 25 ٪ من المتجانسات بين جزيئات متطابقة.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Journal of Biologica...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Journal of Biological Chemistry
    Article . 2006 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Journal of Biological Chemistry
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    https://dx.doi.org/10.60692/0y...
    Other literature type . 2006
    Data sources: Datacite
    https://dx.doi.org/10.60692/d0...
    Other literature type . 2006
    Data sources: Datacite
    82
    citations82
    popularityTop 10%
    influenceTop 10%
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Journal of Biologica...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Journal of Biological Chemistry
      Article . 2006 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Journal of Biological Chemistry
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      https://dx.doi.org/10.60692/0y...
      Other literature type . 2006
      Data sources: Datacite
      https://dx.doi.org/10.60692/d0...
      Other literature type . 2006
      Data sources: Datacite
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Clark W. Bird; Glenna J. Chavez; Megan J. Barber; C. Fernando Valenzuela;

    ABSTRACTPrenatal ethanol exposure causes a variety of cognitive deficits that have a persistent impact on quality of life, some of which may be explained by ethanol-induced alterations in interneuron function. Studies from several laboratories, including our own, have demonstrated that a single binge-like ethanol exposure during the equivalent to the third trimester of human pregnancy leads to acute apoptosis and long-term loss of interneurons in the rodent retrosplenial cortex (RSC). The RSC is interconnected with the hippocampus, thalamus, and other neocortical regions and plays distinct roles in visuospatial processing and storage, as well as retrieval of hippocampal-dependent episodic memories. Here we used slice electrophysiology to characterize the acute effects of ethanol on GABAergic neurotransmission in the RSC of neonatal mice, as well as the long-term effects of neonatal ethanol exposure on parvalbumin-interneuron mediated neurotransmission in adolescent mice. Mice were exposed to ethanol using vapor inhalation chambers. In postnatal day (P) 7 mouse pups, ethanol unexpectedly failed to potentiate GABAAreceptor-mediated synaptic transmission. Binge-like ethanol exposure of P7 mice expressing channel rhodopsin in parvalbumin-positive interneurons enhanced the peak amplitudes, asynchronous activity and total charge, while decreasing the rise-times of optically-evoked GABAAreceptor-mediated inhibitory postsynaptic currents in adolescent animals. These effects could partially explain the learning and memory deficits that have been documented in adolescent and young adult mice exposed to ethanol during the third trimester-equivalent developmental period.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ https://europepmc.or...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    https://europepmc.org/articles...
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Scientific Reports
    Article . 2021 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Scientific Reports
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Scientific Reports
    Article . 2021
    Data sources: DOAJ
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
    Access Routes
    Green
    gold
    9
    citations9
    popularityTop 10%
    influenceAverage
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ https://europepmc.or...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      https://europepmc.org/articles...
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Scientific Reports
      Article . 2021 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Scientific Reports
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Scientific Reports
      Article . 2021
      Data sources: DOAJ
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
Advanced search in Research products
Research products
arrow_drop_down
Searching FieldsTerms
Any field
arrow_drop_down
includes
arrow_drop_down
The following results are related to Energy Research. Are you interested to view more results? Visit OpenAIRE - Explore.
28,168 Research products
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: S. Nithyapriya; Sundaram Lalitha; R. Z. Sayyed; M. S. Reddy; +4 Authors

    Siderophores are low molecular weight secondary metabolites produced by microorganisms under low iron stress as a specific iron chelator. In the present study, a rhizospheric bacterium was isolated from the rhizosphere of sesame plants from Salem district, Tamil Nadu, India and later identified as Bacillus subtilis LSBS2. It exhibited multiple plant-growth-promoting (PGP) traits such as hydrogen cyanide (HCN), ammonia, and indole acetic acid (IAA), and solubilized phosphate. The chrome azurol sulphonate (CAS) agar plate assay was used to screen the siderophore production of LSBS2 and quantitatively the isolate produced 296 mg/L of siderophores in succinic acid medium. Further characterization of the siderophore revealed that the isolate produced catecholate siderophore bacillibactin. A pot culture experiment was used to explore the effect of LSBS2 and its siderophore in promoting iron absorption and plant growth of Sesamum indicum L. Data from the present study revealed that the multifarious Bacillus sp. LSBS2 could be exploited as a potential bioinoculant for growth and yield improvement in S. indicum.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Sustainabilityarrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Sustainability
    Article . 2021 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Sustainability
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Sustainability
    Article . 2021
    Data sources: DOAJ
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    110
    citations110
    popularityTop 1%
    influenceTop 10%
    impulseTop 1%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Sustainabilityarrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Sustainability
      Article . 2021 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Sustainability
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Sustainability
      Article . 2021
      Data sources: DOAJ
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Stewart, Arthur D.; Gardiner, Matthew; MacDonald, Jonathan; Williams, Hector;

    Building, bridge or wind turbine maintenance requires manual dexterity tasks by a specialist rope-access trained workforce via two principal means: harness suspension of individual workers from above, or deployment of a suspended platform or cradle from which workers access the structure to be maintained. Currently no published research compares accuracy and efficiency of simulated maintenance tasks between these modalities. This study investigated manual dexterity task performance of peg placement and shape delineation in seated, standing and suspended environments in 16 healthy controls and 26 professional rope-access trained individuals. Both seated and standing assessments were superior to those suspended, and height of suspension, total mass and years of experience had no influence on the task outcome. These findings suggest that, where feasible, cradle suspension mechanisms which permit standing maintenance are favourable in terms of task efficacy and where feasible, should be considered for deployment in wind energy and other engineering applications.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ OpenAIR@RGU (Robert ...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Applied Ergonomics
    Article
    License: CC BY NC ND
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
    Applied Ergonomics
    Article . 2021 . Peer-reviewed
    License: Elsevier TDM
    Data sources: Crossref
    3
    citations3
    popularityTop 10%
    influenceAverage
    impulseAverage
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ OpenAIR@RGU (Robert ...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Applied Ergonomics
      Article
      License: CC BY NC ND
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
      Applied Ergonomics
      Article . 2021 . Peer-reviewed
      License: Elsevier TDM
      Data sources: Crossref
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Pulmonary Division, Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, and Veterans Administration Medical Center, Gainesville, Florida, USA ( host institution ); Block, A.Jay ( author ); Hellard, Donald W. ( author ); Slayton, Paul C. ( author );

    Breathing and oxygenation were monitored in 78 asymptomatic volunteers on two successive nights of sleep. Four groups of subjects were recruited: 20 young men, 20 young women, 20 men older than 40 years, and 18 postmenopausal women. In random order, subjects ingested either 2 ml/kg (body weight) of 100-proof vodka in orange juice or a similar amount of water in orange juice before bedtime. Alcohol ingestion shortened sleep in the older men and in the postmenopausal women. No effect of alcohol ingestion on breathing or oxygenation during sleep was seen in any group of women. In men, alcohol ingestion increased the numbers of desaturation episodes and caused more severe oxygen desaturation during sleep. The effect of alcohol ingestion on breathing and oxygenation during the sleep of asymptomatic volunteers appears to be limited to men.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ University of Florid...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
    The American Journal of Medicine
    Article . 1986 . Peer-reviewed
    License: Elsevier TDM
    Data sources: Crossref
    48
    citations48
    popularityAverage
    influenceTop 10%
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ University of Florid...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
      The American Journal of Medicine
      Article . 1986 . Peer-reviewed
      License: Elsevier TDM
      Data sources: Crossref
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Frédéric Chevallier; Pierre Regnier; Julia Pongratz; Atul K. Jain; +30 Authors

    Abstract. Regional land carbon budgets provide insights on the spatial distribution of the land uptake of atmospheric carbon dioxide, and can be used to evaluate carbon cycle models and to define baselines for land-based additional mitigation efforts. The scientific community has been involved in providing observation-based estimates of regional carbon budgets either by downscaling atmospheric CO2 observations into surface fluxes with atmospheric inversions, by using inventories of carbon stock changes in terrestrial ecosystems, by upscaling local field observations such as flux towers with gridded climate and remote sensing fields or by integrating data-driven or process-oriented terrestrial carbon cycle models. The first coordinated attempt to collect regional carbon budgets for nine regions covering the entire globe in the RECCAP-1 project has delivered estimates for the decade 2000–2009, but these budgets were not comparable between regions, due to different definitions and component fluxes reported or omitted. The recent recognition of lateral fluxes of carbon by human activities and rivers, that connect CO2 uptake in one area with its release in another also requires better definition and protocols to reach harmonized regional budgets that can be summed up to the globe and compared with the atmospheric CO2 growth rate and inversion results. In this study, for the international initiative RECCAP-2 coordinated by the Global Carbon Project, which aims as an update of regional carbon budgets over the last two decades based on observations, for 10 regions covering the globe, with a better harmonization that the precursor project, we provide recommendations for using atmospheric inversions results to match bottom-up carbon accounting and models, and we define the different component fluxes of the net land atmosphere carbon exchange that should be reported by each research group in charge of each region. Special attention is given to lateral fluxes, inland water fluxes and land use fluxes.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Université de Versai...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    https://doi.org/10.5194/gmd-20...
    Article . 2020 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    https://gmd.copernicus.org/art...
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Geoscientific Model Development (GMD)
    Article . 2022 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Geoscientific Model Development (GMD)
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Geoscientific Model Development
    Article . 2022
    Data sources: DOAJ
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    MPG.PuRe
    Article . 2020
    License: CC BY
    Data sources: MPG.PuRe
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Wageningen Staff Publications
    Article . 2022
    License: CC BY
    https://dx.doi.org/10.60692/vq...
    Other literature type . 2020
    Data sources: Datacite
    https://dx.doi.org/10.60692/am...
    Other literature type . 2020
    Data sources: Datacite
    https://dx.doi.org/10.60692/bz...
    Other literature type . 2022
    Data sources: Datacite
    https://dx.doi.org/10.60692/zf...
    Other literature type . 2022
    Data sources: Datacite
    Access Routes
    Green
    gold
    46
    citations46
    popularityTop 1%
    influenceTop 10%
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    visibility7
    visibilityviews7
    downloaddownloads13
    Powered by Usage counts
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Université de Versai...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      https://doi.org/10.5194/gmd-20...
      Article . 2020 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      https://gmd.copernicus.org/art...
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Geoscientific Model Development (GMD)
      Article . 2022 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Geoscientific Model Development (GMD)
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Geoscientific Model Development
      Article . 2022
      Data sources: DOAJ
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      MPG.PuRe
      Article . 2020
      License: CC BY
      Data sources: MPG.PuRe
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Wageningen Staff Publications
      Article . 2022
      License: CC BY
      https://dx.doi.org/10.60692/vq...
      Other literature type . 2020
      Data sources: Datacite
      https://dx.doi.org/10.60692/am...
      Other literature type . 2020
      Data sources: Datacite
      https://dx.doi.org/10.60692/bz...
      Other literature type . 2022
      Data sources: Datacite
      https://dx.doi.org/10.60692/zf...
      Other literature type . 2022
      Data sources: Datacite
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Jürgens, Hella; Haass, Wiltrud; Castañeda, Tamara R; Schürmann, Annette; +10 Authors

    AbstractObjective: The marked increase in the prevalence of obesity in the United States has recently been attributed to the increased fructose consumption. To determine if and how fructose might promote obesity in an animal model, we measured body composition, energy intake, energy expenditure, substrate oxidation, and several endocrine parameters related to energy homeostasis in mice consuming fructose.Research Methods and Procedures: We compared the effects of ad libitum access to fructose (15% solution in water), sucrose (10%, popular soft drink), and artificial sweetener (0% calories, popular diet soft drink) on adipogenesis and energy metabolism in mice.Results: Exposure to fructose water increased adiposity, whereas increased fat mass after consumption of soft drinks or diet soft drinks did not reach statistical significance (n = 9 each group). Total intake of energy was unaltered, because mice proportionally reduced their caloric intake from chow. There was a trend toward reduced energy expenditure and increased respiratory quotient, albeit not significant, in the fructose group. Furthermore, fructose produced a hepatic lipid accumulation with a characteristic pericentral pattern.Discussion: These data are compatible with the conclusion that a high intake of fructose selectively enhances adipogenesis, possibly through a shift of substrate use to lipogenesis.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Obesity Researcharrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Obesity Research
    Article
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
    Obesity Research
    Article . 2005 . Peer-reviewed
    License: Wiley Online Library User Agreement
    Data sources: Crossref
    Obesity Research
    Article . 2006
    Access Routes
    Green
    bronze
    264
    citations264
    popularityTop 1%
    influenceTop 1%
    impulseTop 1%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Obesity Researcharrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Obesity Research
      Article
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
      Obesity Research
      Article . 2005 . Peer-reviewed
      License: Wiley Online Library User Agreement
      Data sources: Crossref
      Obesity Research
      Article . 2006
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Mauricio Rodriguez-Lanetty; Paulina Kaniewska; Paul R. Campbell; David I. Kline; +5 Authors

    As atmospheric levels of CO(2) increase, reef-building corals are under greater stress from both increased sea surface temperatures and declining sea water pH. To date, most studies have focused on either coral bleaching due to warming oceans or declining calcification due to decreasing oceanic carbonate ion concentrations. Here, through the use of physiology measurements and cDNA microarrays, we show that changes in pH and ocean chemistry consistent with two scenarios put forward by the Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) drive major changes in gene expression, respiration, photosynthesis and symbiosis of the coral, Acropora millepora, before affects on biomineralisation are apparent at the phenotype level. Under high CO(2) conditions corals at the phenotype level lost over half their Symbiodinium populations, and had a decrease in both photosynthesis and respiration. Changes in gene expression were consistent with metabolic suppression, an increase in oxidative stress, apoptosis and symbiont loss. Other expression patterns demonstrate upregulation of membrane transporters, as well as the regulation of genes involved in membrane cytoskeletal interactions and cytoskeletal remodeling. These widespread changes in gene expression emphasize the need to expand future studies of ocean acidification to include a wider spectrum of cellular processes, many of which may occur before impacts on calcification.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ James Cook Universit...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    PLoS ONE
    Article . 2012 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    PLoS ONE
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    PLoS ONE
    Article . 2012
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    PLoS ONE
    Article . 2012
    Data sources: DOAJ
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Access Routes
    Green
    gold
    223
    citations223
    popularityTop 1%
    influenceTop 10%
    impulseTop 1%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ James Cook Universit...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      PLoS ONE
      Article . 2012 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      PLoS ONE
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      PLoS ONE
      Article . 2012
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      PLoS ONE
      Article . 2012
      Data sources: DOAJ
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Sebastien Carnicella; Patricia H. Janak; Dorit Ron; Somayeh Ahmadiantehrani;

    Background:  We previously found that activation of the glial cell line‐derived neurotrophic factor (GDNF) pathway in the ventral tegmental area (VTA) reduces ethanol‐drinking behaviors. In this study, we set out to assess the contribution of endogenous GDNF or its receptor GFRα1 to the regulation of ethanol‐related behaviors.Methods:  GDNF and GFRα1 heterozygote mice (HET) and their wild‐type littermate controls (WT) were used for the studies. Ethanol‐induced hyperlocomotion, sensitization, and conditioned place preference (CPP), as well as ethanol consumption before and after a period of abstinence were evaluated. Blood ethanol concentration (BEC) was also measured.Results:  We observed no differences between the GDNF HET and WT mice in the level of locomotor activity or in sensitization to ethanol‐induced hyperlocomotion after systemic injection of a nonhypnotic dose of ethanol and in BEC. However, GDNF and GFRα1 mice exhibited increased place preference to ethanol as compared with their WT littermates. The levels of voluntary ethanol or quinine consumption were similar in the GDNF HET and WT mice, however, a small but significant increase in saccharin intake was observed in the GDNF HET mice. No changes were detected in voluntary ethanol, saccharin or quinine consumption of GFRα1 HET mice as compared with their WT littermates. Interestingly, however, both the GDNF and GFRα1 HET mice consumed much larger quantities of ethanol after a period of abstinence from ethanol as compared with their WT littermates. Furthermore, the increase in ethanol consumption after abstinence was found to be specific for ethanol as similar levels of saccharin intake were measured in the GDNF and GFRα1 HET and WT mice after abstinence.Conclusions:  Our results suggest that endogenous GDNF negatively regulates the rewarding effect of ethanol and ethanol‐drinking behaviors after a period of abstinence.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Alcoholism Clinical ...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
    Alcoholism Clinical and Experimental Research
    Article . 2009 . Peer-reviewed
    License: Wiley Online Library User Agreement
    Data sources: Crossref
    Access Routes
    Green
    bronze
    38
    citations38
    popularityTop 10%
    influenceTop 10%
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Alcoholism Clinical ...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
      Alcoholism Clinical and Experimental Research
      Article . 2009 . Peer-reviewed
      License: Wiley Online Library User Agreement
      Data sources: Crossref
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Juanjo Rodríguez; Christine M. J. Gallampois; Sari Timonen; Agneta Andersson; +9 Authors

    Coastal ecosystems are highly dynamic and can be strongly influenced by climate change, anthropogenic activities (e.g., pollution), and a combination of the two pressures. As a result of climate change, the northern hemisphere is predicted to undergo an increased precipitation regime, leading in turn to higher terrestrial runoff and increased river inflow. This increased runoff will transfer terrestrial dissolved organic matter (tDOM) and anthropogenic contaminants to coastal waters. Such changes can directly influence the resident biology, particularly at the base of the food web, and can influence the partitioning of contaminants and thus their potential impact on the food web. Bacteria have been shown to respond to high tDOM concentration and organic pollutants loads, and could represent the entry of some pollutants into coastal food webs. We carried out a mesocosm experiment to determine the effects of: (1) increased tDOM concentration, (2) organic pollutant exposure, and (3) the combined effect of these two factors, on pelagic bacterial communities. This study showed significant responses in bacterial community composition under the three environmental perturbations tested. The addition of tDOM increased bacterial activity and diversity, while the addition of organic pollutants led to an overall reduction of these parameters, particularly under concurrent elevated tDOM concentration. Furthermore, we identified 33 bacterial taxa contributing to the significant differences observed in community composition, as well as 35 bacterial taxa which responded differently to extended exposure to organic pollutants. These findings point to the potential impact of organic pollutants under future climate change conditions on the basal coastal ecosystem, as well as to the potential utility of natural bacterial communities as efficient indicators of environmental disturbance.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Frontiers in Microbi...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Frontiers in Microbiology
    Article . 2018 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Frontiers in Microbiology
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Frontiers in Microbiology
    Article . 2018
    Data sources: DOAJ
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Access Routes
    Green
    gold
    31
    citations31
    popularityTop 10%
    influenceAverage
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Frontiers in Microbi...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Frontiers in Microbiology
      Article . 2018 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Frontiers in Microbiology
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Frontiers in Microbiology
      Article . 2018
      Data sources: DOAJ
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/

    Bien que des données pharmacologiques et biochimiques antérieures soutiennent l'idée que les récepteurs muscariniques de l'acétylcholine (mAChR) forment des homo- et hétérodimères, l'existence d'oligomères mAChR dans les cellules vivantes reste controversée. Ici, nous avons utilisé le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence pour démontrer que les mAChR M1, M2 et M3 peuvent former des homo- et hétérodimères constitutifs dans les cellules HEK 293 vivantes. L'analyse quantitative du transfert d'énergie par résonance de bioluminescence a révélé que la population de récepteurs cellulaires dans les cellules exprimant un seul sous-type de M1, M2 ou M3 mAChR est principalement composée d'homodimères de haute affinité. L'analyse de la courbe de saturation des cellules exprimant deux sous-types de récepteurs démontre l'existence d'hétérodimères mAChR de haute affinité M1/M2, M2/M3 et M1/M3, bien que les valeurs d'affinité relative soient légèrement inférieures à celles des homodimères mAChR. Le traitement agoniste à court terme n'a pas modifié le statut oligomérique des homo- et hétérodimères. Lorsqu'il est exprimé dans les cellules JEG-3, le récepteur M2 présente une sensibilité beaucoup plus élevée que le récepteur M3 à la régulation négative induite par les agonistes. La co-expression de M3 mAChR avec des quantités croissantes du sous-type M2 dans les cellules JEG-3 a entraîné une régulation négative accrue de M3 induite par les agonistes, suggérant un nouveau rôle de l'hétérodimérisation dans le mécanisme de la régulation à long terme de mAChR. Bien que des données pharmacologiques et biochimiques antérieures soutiennent l'idée que les récepteurs muscariniques de l'acétylcholine (mAChR) forment des homo- et hétérodimères, l'existence d'oligomères mAChR dans les cellules vivantes reste controversée. Ici, nous avons utilisé le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence pour démontrer que les mAChR M1, M2 et M3 peuvent former des homo- et hétérodimères constitutifs dans les cellules HEK 293 vivantes. L'analyse quantitative du transfert d'énergie par résonance de bioluminescence a révélé que la population de récepteurs cellulaires dans les cellules exprimant un seul sous-type de M1, M2 ou M3 mAChR est principalement composée d'homodimères de haute affinité. L'analyse de la courbe de saturation des cellules exprimant deux sous-types de récepteurs démontre l'existence d'hétérodimères mAChR de haute affinité M1/M2, M2/M3 et M1/M3, bien que les valeurs d'affinité relative soient légèrement inférieures à celles des homodimères mAChR. Le traitement agoniste à court terme n'a pas modifié le statut oligomérique des homo- et hétérodimères. Lorsqu'il est exprimé dans les cellules JEG-3, le récepteur M2 présente une sensibilité beaucoup plus élevée que le récepteur M3 à la régulation négative induite par les agonistes. La co-expression de M3 mAChR avec des quantités croissantes du sous-type M2 dans les cellules JEG-3 a entraîné une régulation négative accrue de M3 induite par les agonistes, suggérant un nouveau rôle de l'hétérodimérisation dans le mécanisme de la régulation à long terme de mAChR. Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études ont montré de nombreuses preuves que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) 3Les abréviations utilisées sont : RCPG, récepteur couplé aux protéines G ; mAChR, récepteur muscarinique de l'acétylcholine ; TMD, domaine transmembranaire ; BRET, transfert d'énergie par résonance de bioluminescence ; RLuc, Renilla luciférase ; YFP, protéine de fluorescence jaune, GFP, protéine de fluorescence verte ; Smo, lissé ; QNB, benzilate de quinuclidinyle ; i3, troisième boucle intracellulaire ; PBS, solution saline tamponnée au phosphate ; HA, hémagglutinine. interagissent les uns avec les autres pour former des homo- ou hétéro-oligomères constitutifs. La dimérisation des RCPG a été impliquée dans de nombreux aspects de la pharmacologie des récepteurs, tels que la maturation, la liaison aux ligands, l'activation, la signalisation, la désensibilisation, l'endocytose et le trafic (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001 ; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002 ; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 3Breitwieser G.E. Circ. Res. 2004 ; 94: 17-27Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). Au début des années 1990, plusieurs études ont montré que les récepteurs muscariniques de l'acétylcholine (mAChR), comme les autres GPCR, pouvaient être organisés en complexes dimères ou oligomères. Des courbes de liaison complexes pour les agonistes et les antagonistes muscariniques ont été interprétées comme des preuves de l'existence de multiples états d'affinité, ce qui est cohérent avec la notion de sites de liaison situés sur des molécules réceptrices dimériques (4Hirschberg B.T. Schimerlik M.I. J. Biol. Chem. 1994 ; 269: 26127-26135Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 5Potter L.T. Ballesteros L.A. Bichajian L.H. Ferrendelli c.a. Fisher A. Hanchett H.E. Zhang R. Mol. Pharmacol. 1991 ; 39: 211-221PubMed Google Scholar). Des études plus récentes sur le mAChR ont montré qu'une telle hétérogénéité d'affinité devrait plutôt être attribuée à des effets coopératifs sensibles aux nucléotides entre sites d'interaction (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992 ; 31: 10908-10921Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar, 7Chidiac P. Green M.A. Pawagi A.B. Wells J.W. Biochemistry. 1997 ; 36: 7361-7379Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar). Parce qu'il semble y avoir un site de liaison par molécule réceptrice, la coopérativité suggère que les mAChR sont en fait des oligomères formés par deux ou plusieurs sites en interaction (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992 ; 31: 10908-10921Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar). Des preuves pharmacologiques supplémentaires que le mAChR peut former des dimères ont été fournies par Maggio et al. (8Maggio R. Vogel Z. Wess J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993 ; 90: 3103-3107Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar), qui a utilisé des récepteurs muscariniques α2-adrénergiques/M3 chimériques composés des cinq premiers domaines transmembranaires (TMD) d'un récepteur et des deux derniers TMD de l'autre. Aucune liaison ou signalisation n'a été détectée lorsque l'une ou l'autre des protéines de fusion a été exprimée seule, mais la coexpression des deux chimères a sauvé l'activité de liaison et les propriétés de signalisation des ligands adrénergiques et muscariniques. Ces résultats ont été interprétés comme des interactions intermoléculaires entre deux récepteurs inactifs maintenant engagés dans un complexe dimérique avec des propriétés fonctionnelles de récepteur restaurées. Cependant, de tels résultats de transcomplémentation ont été contestés en raison du fait que ces interactions intermoléculaires ont été observées en étudiant les récepteurs mutants et non les récepteurs de type sauvage (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001 ; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). La co-immunoprécipitation du mAChR M3 marqué à l'épitope solubilisé et l'analyse par Western blot ont également été utilisées pour démontrer l'existence d'oligomères mAChR de manière directe. Cette approche biochimique a révélé que le M3 mAChR est capable de former des dimères/multimères liés au disulfure ainsi que des dimères/multimères non covalents (9Zeng F.Y. Wess J.J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 19487-19497Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (215) Google Scholar). Bien que les essais de co-immunoprécipitation/immunoblotting fournissent des preuves assez convaincantes de la formation de dimères mAChR, de telles études ont été critiquées pour la possibilité que l'agrégation des récepteurs observée puisse résulter d'un artefact en raison de la présence de préparations concentrées de molécules hautement hydrophobes après le processus de solubilisation (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001 ; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). Au cours de la dernière décennie, plusieurs groupes ont utilisé des essais biophysiques basés sur le transfert d'énergie par résonance lumineuse pour évaluer l'oligomérisation des RCPG (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001 ; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002 ; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004 ; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar, 11Angers S. Salahpour A. Joly E. Hilairet S. Chelsky D. Dennis M. Bouvier M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000 ; 97: 3684-3689PubMed Google Scholar). Le transfert d'énergie de résonance de fluorescence et sa variation, le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET), ont été largement utilisés pour surmonter les limitations technologiques présentes dans les méthodes pharmacologiques et biochimiques car ils ont l'avantage distinct de surveiller les interactions en temps réel entre les protéines synthétisées dans leur emplacement correct dans les cellules vivantes (10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004 ; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar). Dans la méthodologie classique de BRET, la première protéine est fusionnée à la luciférase de Renilla (RLuc), et la deuxième protéine partenaire est fusionnée à une protéine fluorescente (protéine fluorescente jaune (YFP)). Si les deux partenaires interagissent, le transfert d'énergie de résonance entre le RLuc (donneur) et le YFP (accepteur) peut être mesuré lors de l'ajout du substrat RLuc coelentérazine (12Xu Y. Piston D.W. Johnson C.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999 ; 96: 151-156Crossref PubMed Scopus (507) Google Scholar). Dans cette étude, l'occurrence d'homo- et hétéro-oligomères constitutifs parmi les mAChR M1, M2 et M3 a été étudiée dans des cellules vivantes exprimant des niveaux physiologiques de ces récepteurs par BRET. Des expériences de saturation BRET ont été menées pour estimer la capacité relative de chaque sous-type de récepteur à s'engager dans des interactions homo- et hétérotrope. La nature de ces homo-oligomères, la proportion de molécules réceptrices formant ces complexes oligomères et l'effet de l'agoniste muscarinique sur l'homo- et l'hétérodimérisation des mAChR M1, M2 et M3 ont également été abordés. Enfin, nous avons examiné les implications de l'oligomérisation sur la fonction mAChR en déterminant l'effet de l'hétérodimérisation M2/M3 sur la régulation mAChR M3 induite par les agonistes. Matériaux - Le benzilate de [3H] quinuclidinyle ([3H]QNB, 42 Ci/mmol) et la N-[3H]méthylscopolamine (81 Ci/mmol) ont été achetés auprès d'Amersham Biosciences. Le milieu modifié Eagle's de Dulbecco, la pénicilline/streptomycine et le sérum bovin fœtal ont été achetés chez Invitrogen. Les enzymes de restriction provenaient de New England Biolabs (Beverly, MA) et la coelentérazine h a été obtenue de Promega (Madison, WI). L'anticorps polyclonal anti-HA (HA.11) a été acheté à Covance (Berkeley, CA). Le chlorure de carbamylcholine (carbachol), le sulfate d'atropine, l'anticorps monoclonal anti-FLAG M2 et tous les autres réactifs ont été achetés auprès de Sigma. L'anticorps monoclonal contre le M2 mAChR cardiaque porcin a été généré et caractérisé par Luetje et al. (13Luetje C.W. Brumwell C. Norman M.G. Peterson G.L. Schimerlik M.I. Nathanson N.M. Biochemistry. 1987 ; 26: 6892-6896Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Les protéines de fusion mAChR-RLuc et mAChR-YFP ont été construites en ligaturant la luciférase de Renilla (RLuc) et les fractions YFP à l'extrémité C-terminale des récepteurs. Les séquences codantes M1, M2 porcine et M3 mAChR humaines sans leurs codons stop ont été amplifiées en utilisant des amorces sens et antisens hébergeant des sites de restriction uniques. Les fragments ont ensuite été sous-clonés dans le cadre dans pRL-CMV-RLuc (Promega) ou pEYFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA). Les sites de restriction utilisés étaient les suivants : XhoI/BamHI (M1-RLuc, M1-YFP), XhoI/SacII (M2-RLuc, M2-YFP), EcoRV/BamHI (M3-RLuc) et EcoRI/BamHI (M3-YFP). pEYFP a été coupé avec AgeI et BsrGI, et le fragment YFP a été inséré dans le site AgeI/BsrGI à partir de Smoothened-GFP humain (Smo-GFP) pour donner Smo-YFP. Smo-GFP a été fourni par le Dr A. Kaykas (Université de Washington). Le plasmide d'expression HA-M3 mAChR a été obtenu auprès du Centre de ressources en ADNc de l'Université du Missouri-Rolla (Rolla, MO). Toutes les autres constructions ont été décrites ailleurs (14Nadler L.S. Kumar G. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 10539-10547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar, 15Kaykas A. Yang-Snyder J. Héroux M. Shah K.V. Bouvier M. Moon R.T. Nat. Cell Biol. 2004 ; 6: 52-58Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). Culture et transfection cellulaires : des cellules HEK 293 ou JEG-3 ont été cultivées dans le milieu Eagle's modifié de Dulbecco supplémenté avec 10% (v/v) de sérum bovin fœtal et de pénicilline (100 unités/ml)/sulfate de streptomycine (0,1 mg/ml) à 37 °C dans un environnement humidifié à 10% de CO2. Des transfections transitoires ont été effectuées sur des cellules qui étaient à 70–80% de confluence en utilisant le protocole de précipitation de phosphate de calcium (16Mellon P. Parker V. Gluzman Y. Maniatis T. Cell. 1981 ; 27: 279-288Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (335) Google Scholar). La caractérisation pharmacologique des constructions - Les cellules HEK 293 cultivées dans des boîtes de 15 cm ont été transfectées avec un RAChR marqué au RLuc, marqué au YFP ou non marqué (12,5-25 μg d'ADN/plaque). Après une période de 36 h après la transfection, les cellules ont été lavées avec du PBS glacé et les membranes ont été obtenues comme décrit précédemment (17 Goin J.C. Nathanson N.M. J. Neurochem. 2002 ; 83: 964-972Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar). Des études de liaison à la saturation ont été réalisées en incubant des membranes avec des concentrations croissantes de [3H]QNB à 37 °C pendant 90 min dans du phosphate de sodium/potassium de 50 mm, pH 7,4. L'atropine (1 μm) a été utilisée pour définir la liaison non spécifique. La réaction a été arrêtée par filtration rapide sur filtres en fibre de verre GF/C (Whatman). Les filtres ont ensuite été lavés quatre fois avec du tampon phosphate froid, et la radioactivité retenue a été déterminée par comptage par scintillation. Les courbes ont été analysées par analyse de régression non linéaire à l'aide du logiciel Prism 4 (GraphPad, San Diego). Dosages de BRET - Trente six heures après la transfection, les cellules HEK 293 ont été distribuées dans des microplaques de 96 puits (Isoplate opaque blanc, Wallac) lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remises en suspension dans du PBS/glucose 0,1% en présence ou en l'absence de 10 μm de carbachol à 25 °C. La coélentérazine h a été ajoutée à une concentration finale de 5 μm et l'intensité lumineuse a été intégrée séquentiellement dans les fenêtres 510–590 et 440–500 nm à l'aide d'un lecteur multiplaques Victor2 (PerkinElmer Life Sciences). LE rapport de BRET a été défini comme ((émission à 510-590)/(émission à 440–500)) – Cf, où Cf correspondait à (émission à 510-590)/(émission à 440–500) pour les constructions du récepteur RLuc exprimées seules dans les mêmes expériences. Mesures de fluorescence et de luminescence - Les cellules HEK 293 transfectées de manière transitoire ont été récoltées, lavées et remises en suspension comme décrit ci-dessus, puis distribuées dans des microplaques à 96 puits (isoplates opaques à fond clair ou blancs pour les déterminations de fluorescence et de luminescence, respectivement). Les deux déterminations ont également été réalisées dans un lecteur multiplaques Victor2. La fluorescence totale des cellules a été mesurée à l'aide d'un filtre d'excitation de 485 nm et d'un filtre d'émission de 535 nm. Pour évaluer l'activité de la luciférase de Renilla, la luminescence totale a été déterminée sur des échantillons incubés avec de la coélentérazine de 5 μm. Pour les deux mesures, les moyennes de puits en double ont été calculées. Les valeurs de fluorescence totale ont ensuite été divisées par le fond déterminé dans des puits contenant des cellules non transfectées. Les valeurs de fond pour la luminescence totale étaient négligeables, et elles ont été soustraites des valeurs de l'échantillon. Titrage des protéines de fusion donneuses et acceptrices - Les niveaux d'expression des constructions mAChR-RLuc et mAChR-YFP ont été surveillés en mesurant la luminescence et la fluorescence, respectivement, comme décrit ci-dessus. Cette procédure est basée sur l'observation que les niveaux de luminescence et de fluorescence de plusieurs protéines de fusion récepteur-RLuc et récepteur-YFP (ou récepteur-GFP) ont été trouvés en corrélation linéaire avec les nombres de récepteurs (18Ayoub M.A. Levoye A. Delagrange P. Jockers R. Mol. Pharmacol. 2004 ; 66: 312-321Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). Parce que cette corrélation est une propriété intrinsèque de chaque protéine de fusion, nous avons testé si nos protéines de fusion mAChR suivaient un modèle de corrélation linéaire. Ainsi, nous avons exprimé chaque mAChR-RLuc ou mAChR-YFP à différents niveaux dans les cellules HEK 293 et évalué la relation entre l'activité luciférase ou la fluorescence, respectivement, et la quantité de sites de liaison mAChR dans les mêmes cellules. Trente-six heures après la transfection, environ20 000 cellules HEK 293 ont été incubées avec 1 nm [3H]QNB dans du PBS, 0,1% de glucose pendant 90 min à 25 °C. La liaison non spécifique a été déterminée en présence de 1 μm d'atropine. La réaction a été arrêtée par filtration rapide sur des filtres en fibre de verre GF/C, qui ont ensuite été lavés quatre fois avec du PBS froid. La radioactivité retenue a été déterminée comme décrit ci-dessus. La luminescence et la fluorescence (unités arbitraires) ont été tracées par rapport aux sites de liaison totaux, et des courbes de régression linéaire ont été obtenues (Fig. 2). Ces courbes standard générées pour chaque expérience ont été utilisées pour transformer les valeurs de fluorescence et de luminescence en femtomoles de récepteur. Ainsi, les rapports fluorescence/luminescence ont été transformés en rapports (récepteur-YFP)/(récepteur-RLuc), ce qui nous a permis de déterminer des valeurs précises de BRETmax et de BRET50 (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M.J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). La concentration en protéines des échantillons a été déterminée pour contrôler le nombre de cellules et également pour exprimer les nombres de récepteurs en femtomole/mg de protéine cellulaire totale, en utilisant la méthode standard décrite par Lowry et al. (20Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. Randall R.J.J. Biol. Chem. 1951 ; 193: 265-275Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Receptor Down-regulation Assays—Determination of agonist-induced M2 or M3 mAChR down-regulation was achieved using the binding of the membrane-permeable muscarinic ligand [3H]QNB to intact cells expressed either mAChR subtype, as described previously (21Schlador M.L. Grubbs R.D. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 2000 ; 275: 23295-23302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (33) Google Scholar). Brièvement, les cellules JEG-3 ont été transfectées de manière transitoire avec des constructions d'ADN M2 ou FLAG-M3 mAChR. Quarante-huit heures plus tard, les cellules ont été incubées soit avec 1 mm de carbachol pendant différents temps (dans un intervalle de 0 à 12 h), soit en présence de diverses concentrations de carbachol pendant 12 h à 37 °C. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS glacé et marquées avec une concentration saturante de [3H]QNB (∼1 nm) dans du PBS pendant 90 min à 37 °C. La liaison non spécifique a été déterminée en présence de 1 μm d'atropine. Les cellules marquées ont été lavées avec du PBS glacé et filtrées sur des filtres à membrane GF/C (Whatman). Les filtres ont ensuite été lavés avec du PBS glacé, transférés dans des flacons de scintillation et combinés avec du liquide de scintillation avant la détermination de la radioactivité par comptage de scintillation. La régulation négative des cellules M2 et M3 mAChR—JEG-3 co-exprimées a été transfectée avec M2 mAChR, FLAG-M3 mAChR, ou les deux constructions d'ADN à des proportions différentes en suivant la procédure indiquée ci-dessus. Quarante-huit heures après la transfection, les cellules ont été traitées avec 10 μm de carbachol pendant 12 h à 37 °C. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS glacé, récoltées dans un tampon phosphate de sodium/potassium de 50 mm, pH 7,4, supplémentées avec des inhibiteurs de protéase (10 μg/ml de leupeptine, 70 μg/ml de fluorure de phénylméthanesulfonyle et 0,25 μg/ml de pepstatine A), et ont été homogénéisées en verre. Les membranes ont été obtenues comme décrit précédemment (17 Goin J.C. Nathanson N.M. J. Neurochem. 2002 ; 83: 964-972Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar), et le nombre total de mAChR dans les homogénats membranaires bruts a été déterminé en utilisant la liaison de [3H]QNB telle que décrite par Halvorsen et Nathanson (22Halvorsen S.W. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1981 ; 256: 7941-7948Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Les nombres de M2 et FLAG-M3 mAChR ont été mesurés par le test d'immunoprécipitation décrit précédemment (23McKinnon L.A. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1995 ; 270: 20636-20642Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar) en utilisant des anticorps monoclonaux anti-M2 et anti-FLAG, respectivement. Alternativement, des expériences de contrôle ont été réalisées en cotransfectant des cellules avec FLAG-M3 mAChR et HA-M3 mAChR à différents niveaux d'expression relative, tels que déterminés par immunoprécipitation en utilisant des anticorps anti-FLAG et anti-HA (23McKinnon L.A. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1995 ; 270: 20636-20642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar). L'étendue de la régulation négative du FLAG-M3 après le traitement au carbachol a ensuite été déterminée comme indiqué ci-dessus. Analyse des données - Les courbes de saturation de bret ont été analysées à l'aide du logiciel Prism 4. Les isothermes ont été ajustées à l'aide d'une équation de régression non linéaire en supposant un seul site de liaison, ce qui a fourni les valeurs BRETmax et BRET50. La corrélation entre la fluorescence ou la luminescence et la densité des récepteurs a été analysée par ajustement de la courbe de régression linéaire avec le même logiciel. La signification statistique des différences dans la régulation du mAChR M2 versus M3 a été évaluée par le test t de Student bilatéral non apparié. L'homo- et l'hétérodimérisation des mAChR M1, M2 et M3 ont été évaluées dans des cellules HEK 293 vivantes par analyse quantitative de BRET. À cette fin, les trois sous-types de mAChR ont été fusionnés au niveau de leur terminaison C au donneur d'énergie RLuc ou à l'accepteur YFP. Pour nous assurer que les protéines de fusion exprimées étaient des polypeptides correctement repliés capables de se lier aux ligands muscariniques, nous avons évalué leurs propriétés de liaison par des tests de liaison à la saturation utilisant l'antagoniste muscarinique [3H]QNB. Une analyse détaillée des valeurs de Kd obtenues à partir de ces courbes de saturation (tableau 1) a indiqué que les modifications à l'extrémité C terminale des mAChR M1, M2 et M3 ne modifiaient pas significativement l'affinité pour le radioligand muscarinique par rapport aux récepteurs de type sauvage. Dans un autre ensemble d'expériences, toutes les constructions ont été exprimées individuellement dans les cellules HEK 293, et la liaison du ligand muscarinique imperméable à la membrane N-[3H]méthylscopolamine a été déterminée en parallèle avec la liaison de l'antagoniste muscarinique perméable à la membrane [3H]QNB à des concentrations de radioligand saturantes pour chaque récepteur exprimé. Parce qu'aucune différence significative n'a été trouvée entre les niveaux de liaison des deux radioligands au même récepteur, 4J. C. Goin et N. M. Nathanson, observations non publiées. nous avons conclu que toutes les protéines de fusion sont exprimées à la surface cellulaire et qu'une telle colocalisation assure leurs chances d'interagir les unes avec les autres.TABLE 1Paramètres de liaison des constructions M1, M2 et M3 mAChRConstruireKdpmM1 mAChR-RLuc13.7 ± 0,9M1 mAChR-YFP13.0 ± 0,7WT-M1 mAChR11.7 ± 2,0M2 mAChR-RLuc19.4 ± 2,0M2 mAChR-YFP24.6 ± 3,3WT-M2 mAChR24.0 ± 2,8M3 mAChR-RLuc38.6 ± 3,2M3 mAChR-YFP33.6 ± 4,2WT-M3 mAChR37.8 ± 2,5 Ouvrir la table dans un nouvel onglet Pour déterminer si M1, M2 et M3 mAChR peuvent former des homodimères dans des cellules intactes, nous avons évalué la capacité des mAChR et mAChR étiquetés par RLuc et YFP à interagir les uns avec les autres par analyse de la courbe de Breturation. Les cellules HEK 293 ont été co-transfectées de manière transitoire avec une quantité constante de la construction RLuc et des quantités croissantes de la construction YFP, et le transfert d'énergie entre les deux protéines de fusion a été mesuré lors de l'addition du substrat de la luciférase Renilla, la cœlentérazine h. Les niveaux d'expression de chaque récepteur marqué RLuc ont été évalués par détection de la luminescence totale de la réaction de luciférase précédente, et les niveaux d'expression des récepteurs marqués YFP ont été surveillés par détermination de la fluorescence totale. Parce que les niveaux d'expression des constructions RLuc ont été trouvés modifiés par la co-transfection de quantités croissantes de leurs partenaires YFP, les signaux BRET ont été tracés en fonction du rapport fluorescence/luminescence. La co-expression des molécules donneuses M1, M2 ou M3 avec leurs partenaires accepteurs homologues a entraîné des isothermes de saturation classiques (Fig. 1, A–C), dans laquelle les signaux de BRET augmentent en fonction hyperbolique de la concentration de l'accepteur, atteignant une asymptote qui correspond à la saturation de tous les donneurs de BRET par les molécules acceptrices. Cette observation suggère que les mAChR M1, M2 et M3 forment des homodimères constitutifs dans les cellules vivantes. Pour nous assurer que ces signaux BRET ne résultaient pas d'une interaction parasite entre RLuc et YFP, nous avons effectué des tests de contrôle dans lesquels chaque mAChR marqué par RLuc était coexprimé avec des quantités croissantes de YFP soluble. Ces essais de saturation ont donné lieu à des courbes quasi-linéaires montrant des signaux de BRET marginaux, qui indiquent une interaction non spécifique entre les deux partenaires coexprimés dans chaque cas. La sélectivité de l'interaction entre le donneur et l'accepteur mAChR a ensuite été évaluée pour exclure la possibilité de signaux BRET non spécifiques en raison de la surexpression des protéines transmembranaires. Le récepteur de signalisation transmembranaire sept apparenté à distance Smoothened fusionné à YFP (Smo-YFP) a été cotransfecté avec M1, M2 ou M3 mAChR-RLuc, ce qui a entraîné une diminution spectaculaire du rapport BRET pour les trois mAChR testés. En revanche, la coexpression de Smo-RLuc avec des quantités croissantes de Smo-YFP a donné des niveaux de BRET significativement plus élevés (figure supplémentaire 1), indiquant que Smo-RLuc est effectivement capable de former des dimères constitutifs dans des cellules intactes lorsqu'il est coexprimé avec un partenaire spécifique. Les données de BRET n'ont pas été influencées par la position relative de RLuc ou de YFP sur les paires de récepteurs car des résultats identiques ont été obtenus pour l'orientation réciproque. 4J. C. Goin et N. M. Nathanson, observations inédites. Ces données confirment notre observation précédente, indiquant que les protéines de fusion donneur et accepteur M1, M2 et M3 sont engagées dans des interactions spécifiques en tant qu'homodimères constitutifs. Bien que les courbes de saturation présentées précédemment suggèrent que le donneur et l'accepteur M1, M2 et M3 interagissent spécifiquement les uns avec les autres, elles ne fournissent pas suffisamment d'informations sur les paramètres de liaison requis pour une analyse quantitative appropriée des interactions récepteur-récepteur. Par conséquent, nous avons mené un nouvel ensemble d'expériences de saturation dans lesquelles la quantité de chaque récepteur effectivement exprimée dans les cellules transfectées a été surveillée, pour chaque expérience individuelle, en corrélant à la fois la luminescence totale et la fluorescence totale avec le nombre de sites de liaison au [3H] QNB. L'analyse de cette corrélation montre une relation linéaire entre la luminescence totale et la densité des récepteurs sans différences significatives entre les pentes obtenues pour les trois sous-types de récepteurs mAChR (figure supplémentaire 2). L'analyse de corrélation entre la fluorescence totale et le nombre total de récepteurs a également donné des courbes linéaires. Cependant, la pente obtenue pour M1-YFP était significativement plus élevée que celle obtenue pour M2-YFP ou M3-YFP. Les équations de régression linéaire présentées dans la figure 2 supplémentaire ont été utilisées pour transformer les unités de fluorescence et de luminescence en nombres de récepteurs, et les signaux BRET ont été tracés en fonction du rapport (nombre de récepteurs-YFP)/(nombre de récepteurs-RLuc). Ces nouvelles courbes de saturation de BRET se sont également comportées comme des fonctions hyperboliques atteignant un niveau de saturation (Fig. 2). Selon l'analyse classique de l'interaction protéine-protéine surveillée par BRET en supposant un site de liaison, la concentration de l'accepteur donnant 50% du transfert d'énergie (BRET50) explique l'affinité relative entre les deux protomères en interaction, et le signal BRET maximal dépend du nombre total de dimères formés ainsi que de la distance entre le donneur et l'accepteur dans le dimère (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M.J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Lors de la comparaison des courbes obtenues pour les homodimères mAChR M1, M2 et M3 (tableau 2), aucune différence significative dans les valeurs de BRET50 n'a été trouvée, indiquant que les affinités des protomères les uns pour les autres sont similaires parmi les trois sous-types de mAChR étudiés. D'autre part, la valeur BRETmax pour la paire donneur-accepteur M1 s'est avérée significativement différente de celle des homodimères M2 et M3. En effet, le BRETmax pour la paire M1-RLuc/M1-YFP était plus de deux fois plus élevé que les autres valeurs de BRETmax. Cela pourrait indiquer qu'un pourcentage plus élevé du sous-type M1 est engagé dans l'homodimérisation ou que le transfert d'énergie entre RLuc et YFP au sein de l'homodimère M1 est plus efficace que celui des homodimères M2 et M3. Comme les affinités relatives entre chacun des partenaires se sont avérées très similaires entre les trois sous-types de récepteurs (tableau 2), la deuxième hypothèse est plus probable. De plus, le fait que les courbes de corrélation entre la fluorescence totale et la densité des récepteurs aient donné une valeur de pente plus élevée pour M1 suggère que YFP fonctionne comme un accepteur plus efficace lorsqu'il est fusionné au sous-type de récepteur M1, ce qui peut entraîner des valeurs de BRET plus élevées pour cette paire. 2Homodimérisation de M1, M2 et M3 mAChR ; paramètres des courbes de saturation de BretPaire transfectéeBRETmaxBRET50% des récepteurs existants en tant qu'homo-oligomères dimères M1-RLuc/M1-YFP0.285 ± 0.0071.83 ± 0.1472 ± 4M2-RLuc/M2-YFP0.139 ± 0.0041.70 ± 0.2378 ± 8M3-RLuc/M3-YFP0.128 ± 0.0031.41 ± 0.1383 ± 6 Tableau ouvert dans un nouvel onglet Pour évaluer la nature des homo-oligomères M1, M2 et M3 mAChR, nous avons comparé leurs courbes de saturation expérimentales correspondantes (Fig. 2) avec celles attendues pour les complexes dimères, trimères et tétramères en utilisant une modification de l'équation par Veatch et Stryer (24Veatch W. Stryer L. Mol J. Biol. 1977 ; 113: 89-102Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar). Cette formule décrit la probabilité de formation de complexes BRET-compétents en fonction de la taille oligomérique du récepteur (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M.J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Les courbes expérimentales correspondent mieux à la courbe théorique prédite pour un dimère plutôt qu'à celles attendues pour un trimère ou un tétramère, suggérant que la fraction oligomère des populations M1, M2 ou M3 mAChR est principalement composée de complexes dimères (Fig. 3). Analyse quantitative détaillée de l'homodimérisation des récepteurs β2-adrénergiques par Mercier et al. (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M.J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 44925-44931Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar) suggère qu'il est possible d'estimer la proportion de récepteurs engagés dans la dimérisation. En supposant un équilibre libre entre les protéines de fusion donneur et accepteur, seulement 50 % des dimères devraient générer BRET si les deux partenaires sont exprimés à des concentrations équimolaires, car chaque partenaire peut également générer 25 % d'homodimères entre des molécules identiques. Aunque los datos farmacológicos y bioquímicos anteriores respaldan la noción de que los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR) forman homo y heterodímeros, la existencia de oligómeros de mAChR en células vivas sigue siendo motivo de controversia. Aquí utilizamos la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia para demostrar que mAChR M1, M2 y M3 puede formar homo y heterodímeros constitutivos en células HEK 293 vivas. El análisis cuantitativo de transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia ha revelado que la población de receptores celulares en células que expresan un solo subtipo de mAChR M1, M2 o M3 está compuesta predominantemente por homodímeros de alta afinidad. El análisis de la curva de saturación de las células que expresan dos subtipos de receptores demuestra la existencia de heterodímeros mAChR M1/M2, M2/M3 y M1/M3 de alta afinidad, aunque los valores de afinidad relativa fueron ligeramente inferiores a los de los homodímeros mAChR. El tratamiento con agonistas a corto plazo no modificó el estado oligomérico de los homodímeros y heterodímeros. Cuando se expresa en células JEG-3, el receptor M2 exhibe una susceptibilidad mucho mayor que el receptor M3 a la regulación negativa inducida por agonistas. La coexpresión de M3 mAChR con cantidades crecientes del subtipo M2 en células JEG-3 dio como resultado una mayor regulación negativa de M3 inducida por agonistas, lo que sugiere un nuevo papel de la heterodimerización en el mecanismo de regulación a largo plazo de mAChR. Aunque los datos farmacológicos y bioquímicos anteriores respaldan la noción de que los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR) forman homo y heterodímeros, la existencia de oligómeros de mAChR en células vivas sigue siendo motivo de controversia. Aquí utilizamos la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia para demostrar que mAChR M1, M2 y M3 puede formar homo y heterodímeros constitutivos en células HEK 293 vivas. El análisis cuantitativo de transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia ha revelado que la población de receptores celulares en células que expresan un solo subtipo de mAChR M1, M2 o M3 está compuesta predominantemente por homodímeros de alta afinidad. El análisis de la curva de saturación de las células que expresan dos subtipos de receptores demuestra la existencia de heterodímeros mAChR M1/M2, M2/M3 y M1/M3 de alta afinidad, aunque los valores de afinidad relativa fueron ligeramente inferiores a los de los homodímeros mAChR. El tratamiento con agonistas a corto plazo no modificó el estado oligomérico de los homodímeros y heterodímeros. Cuando se expresa en células JEG-3, el receptor M2 exhibe una susceptibilidad mucho mayor que el receptor M3 a la regulación negativa inducida por agonistas. La coexpresión de M3 mAChR con cantidades crecientes del subtipo M2 en células JEG-3 dio como resultado una mayor regulación negativa de M3 inducida por agonistas, lo que sugiere un nuevo papel de la heterodimerización en el mecanismo de regulación a largo plazo de mAChR. Durante la última década, muchos estudios han demostrado una amplia evidencia de que los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) 3Las abreviaturas utilizadas son: GPCR, receptor acoplado a la proteína G; mAChR, receptor muscarínico de acetilcolina; TMD, dominio transmembrana; BRET, transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia; RLuc, luciferasa de Renilla; YFP, proteína de fluorescencia amarilla, GFP, proteína de fluorescencia verde; Smo, suavizado; QNB, quinuclidinil bencilato; i3, tercer bucle intracelular; PBS, solución salina tamponada con fosfato; HA, hemaglutinina. interactúan entre sí para formar homo o heterooligómeros constitutivos. La dimerización de GPCR se ha implicado en muchos aspectos de la farmacología del receptor, como la maduración, la unión al ligando, la activación, la señalización, la desensibilización, la endocitosis y el tráfico (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 3Breitwieser G.E. Circ. Res. 2004; 94: 17-27Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). A principios de la década de 1990, varios estudios mostraron que los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR), al igual que otros GPCR, podrían estar dispuestos en complejos diméricos u oligoméricos. Las curvas de unión complejas para agonistas y antagonistas muscarínicos se interpretaron como evidencia de la existencia de múltiples estados de afinidad, lo que es consistente con la noción de sitios de unión ubicados en moléculas receptoras diméricas (4Hirschberg B.T. Schimerlik M.I. J. Biol. Chem. 1994; 269: 26127-26135Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 5Potter L.T. Ballesteros L.A. Bichajian L.H. Ferrendelli C.A. Fisher A. Hanchett H.E. Zhang R. Mol. Pharmacol. 1991; 39: 211-221PubMed Google Scholar). Estudios más recientes sobre mAChR han demostrado que dicha heterogeneidad de afinidad debería atribuirse más bien a los efectos cooperativos sensibles a los nucleótidos entre los sitios de interacción (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992; 31: 10908-10921Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar, 7Chidiac P.A. Green M.A. Pawagi A.B. Wells J.W. Biochemistry. 1997; 36: 7361-7379Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar). Debido a que parece haber un sitio de unión por molécula receptora, la cooperatividad sugiere que mAChR son en realidad oligómeros formados por dos o más sitios de interacción (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992; 31: 10908-10921 Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar). La evidencia farmacológica adicional de que mAChR puede formar dímeros fue proporcionada por Maggio et al. (8Maggio R. Vogel Z. Wess J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 3103-3107Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar), que utilizó receptores muscarínicos α2-adrenérgicos/M3 quiméricos compuestos por los primeros cinco dominios transmembrana (TMD) de un receptor y los dos últimos TMD del otro. No se detectó unión o señalización cuando cualquiera de las proteínas de fusión se expresó sola, pero la coexpresión de ambas quimeras rescató la actividad de unión y las propiedades de señalización de los ligandos adrenérgicos y muscarínicos. Estos resultados se interpretaron como interacciones intermoleculares entre dos receptores inactivos que ahora participan en un complejo dimérico con propiedades funcionales del receptor restauradas. Sin embargo, dichos resultados de transcomplementación se han cuestionado debido al hecho de que esas interacciones intermoleculares se observaron estudiando receptores mutantes y no receptores de tipo salvaje (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). La coinmunoprecipitación de mAChR M3 marcado con epítopo solubilizado y el análisis de transferencia Western también se han empleado para demostrar la existencia de oligómeros de mAChR de forma directa. Este enfoque bioquímico reveló que el mAChR M3 es capaz de formar dímeros/multímeros unidos por disulfuro, así como no covalentes (9Zeng F.Y. Wess J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 19487-19497Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (215) Google Scholar). Aunque los ensayos de coinmunoprecipitación/inmunotransferencia proporcionan pruebas bastante convincentes de la formación de dímeros de mAChR, dichos estudios han sido criticados por la posibilidad de que la agregación de receptores observada podría ser el resultado de un artefacto debido a la presencia de preparaciones concentradas de moléculas altamente hidrófobas después del proceso de solubilización (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). Durante la última década, varios grupos han utilizado ensayos biofísicos basados en la transferencia de energía de resonancia de luz para evaluar la oligomerización de GPCR (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar, 11Angers S. Salahpour A. Joly E. Hilairet S. Chelsky D. Dennis M. Bouvier M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 3684-3689PubMed Google Scholar). La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y su variación, la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), se han utilizado ampliamente para superar las limitaciones tecnológicas presentes en los métodos farmacológicos y bioquímicos porque tienen la clara ventaja de monitorear las interacciones en tiempo real entre las proteínas sintetizadas en su ubicación correcta en las células vivas (10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar). En la metodología clásica de BRET, la primera proteína se fusiona con la luciferasa de Renilla (RLuc), y el segundo compañero de proteína se fusiona con una proteína fluorescente (proteína fluorescente amarilla (YFP)). Si ambos socios interactúan, la transferencia de energía de resonancia entre RLuc (donante) y el YFP (aceptor) se puede medir tras la adición del sustrato RLuc coelenterazina (12Xu Y. Piston D.W. Johnson C.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 151-156Crossref PubMed Scopus (507) Google Scholar). En este estudio, BRET investigó la aparición de homo y heterooligómeros constitutivos entre mAChR M1, M2 y M3 en células vivas que expresan niveles fisiológicos de estos receptores. Se realizaron experimentos de saturación de BRET para estimar la capacidad relativa de cada subtipo de receptor para participar en interacciones homo y heterotrópicas. También se abordaron la naturaleza de dichos homooligómeros, la proporción de moléculas receptoras que forman esos complejos oligoméricos y el efecto del agonista muscarínico en la homo y heterodimerización de mAChR M1, M2 y M3. Finalmente, examinamos las implicaciones de la oligomerización en la función de mAChR determinando el efecto de la heterodimerización de M2/M3 en la regulación de mAChR de M3 inducida por agonistas. Materiales: el bencilato de [3H] quinuclidinilo ([3H]QNB, 42 Ci/mmol) y la N-[3H]metilscopolamina (81 Ci/mmol) se adquirieron de Amersham Biosciences. El medio de Eagle modificado por Dulbecco, la penicilina/estreptomicina y el suero fetal bovino se adquirieron en Invitrogen. Las enzimas de restricción eran de New England Biolabs (Beverly, MA), y la coelenterazina h se obtuvo de Promega (Madison, WI). El anticuerpo policlonal anti-HA (HA.11) se adquirió de Covance (Berkeley, CA). El cloruro de carbamilcolina (carbacol), el sulfato de atropina, el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 y todos los demás reactivos se adquirieron de Sigma. El anticuerpo monoclonal contra el mAChR cardíaco porcino M2 fue generado y caracterizado por Luetje et al. (13Luetje C.W. Brumwell C. Norman M.G. Peterson G.L. Schimerlik M.I. Nathanson N.M. Biochemistry. 1987; 26: 6892-6896 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Constructos de receptor: las proteínas de fusión mAChR-RLuc y mAChR-YFP se construyeron ligando la luciferasa de Renilla (RLuc) y los restos de YFP al extremo C-terminal de los receptores. Las secuencias codificantes de mAChR de M1 de ratón, M2 porcino y M3 humano sin sus codones de terminación se amplificaron mediante el uso de cebadores sentido y antisentido que albergan sitios de restricción únicos. Luego, los fragmentos se subclonaron dentro del marco en pRL-CMV-RLuc (Promega) o pEYFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA). Los sitios de restricción utilizados fueron los siguientes: XhoI/BamHI (M1-RLuc, M1-YFP), XhoI/SacII (M2-RLuc, M2-YFP), EcoRV/BamHI (M3-RLuc) y EcoRI/BamHI (M3-YFP). pEYFP se cortó con AgeI y BsrGI, y el fragmento YFP se insertó en el sitio AgeI/BsrGI de Smoothened-GFP humano (Smo-GFP) para dar Smo-YFP. Smo-GFP fue proporcionado por el Dr. A. Kaykas (Universidad de Washington). El plásmido de expresión HA-M3 mAChR se obtuvo del Centro de Recursos de ADNc de la Universidad de Missouri-Rolla (Rolla, MO). Todas las demás construcciones se han descrito en otra parte (14Nadler L.S. Kumar G. Nathanson N.M.J. Biol. Chem. 2001; 276: 10539-10547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar, 15Kaykas A. Yang-Snyder J. Héroux M. Shah K.V. Bouvier M. Moon R.T. Nat. Cell Biol. 2004; 6: 52-58Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). Cultivo y transfección celular: se cultivaron células HEK 293 o JEG-3 en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10% (v/v) y penicilina (100 unidades/ml)/sulfato de estreptomicina (0,1 mg/ml) a 37 °C en un entorno humidificado con 10% de CO2. Las transfecciones transitorias se realizaron en células que estaban en una confluencia del 70-80% usando el protocolo de precipitación con fosfato de calcio (16Mellon P. Parker V. Gluzman Y. Maniatis T. Cell. 1981; 27: 279-288Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (335) Google Scholar). Caracterización farmacológica de constructos: las células HEK 293 cultivadas en placas de 15 cm se transfectaron con mAChR etiquetado con RLuc, etiquetado con YFP o no etiquetado (12.5-25 μg de ADN/placa). Después de un período de 36 h después de la transfección, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y se obtuvieron membranas como se describió anteriormente (17Goin J.C. Nathanson N.M.J. Neurochem. 2002; 83: 964-972 Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar). Los estudios de unión por saturación se realizaron incubando membranas con concentraciones crecientes de [3H]QNB a 37 °C durante 90 min en fosfato de sodio/potasio 50 mm, pH 7,4. Se utilizó atropina (1 μm) para definir la unión inespecífica. La reacción se detuvo mediante filtración rápida sobre filtros de fibra de vidrio GF/C (Whatman). A continuación, los filtros se lavaron cuatro veces con tampón de fosfato frío y se determinó la radiactividad retenida mediante recuento de centelleo. Las curvas se analizaron mediante análisis de regresión no lineal utilizando el software Prism 4 (GraphPad, San Diego). Ensayos BRET: treinta y seis horas después de la transfección, las células HEK 293 se distribuyeron en microplacas de 96 pocillos (isoplaca opaca blanca, Wallac) lavadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en PBS/glucosa al 0,1% en presencia o ausencia de 10 μm de carbacol a 25 °C. Se añadió coelenterazina h a una concentración final de 5 μm, y la intensidad de la luz se integró secuencialmente en las ventanas de 510–590 y 440–500 nm utilizando un lector de múltiples placas Victor2 (PerkinElmer Life Sciences). La relación de BRET se definió como ((emisión a 510–590)/(emisión a 440–500)) – Cf, donde Cf correspondía a (emisión a 510–590)/(emisión a 440–500) para las construcciones de receptor RLuc expresadas solas en los mismos experimentos. Mediciones de fluorescencia y luminiscencia: se recolectaron células HEK 293 transfectadas de forma transitoria, se lavaron y se resuspendieron como se describió anteriormente y luego se distribuyeron en microplacas de 96 pocillos (isoplacas opacas de fondo transparente o blancas para determinaciones de fluorescencia y luminiscencia, respectivamente). Ambas determinaciones también se llevaron a cabo en un lector multiplaca Victor2. La fluorescencia total de las células se midió utilizando un filtro de excitación de 485 nm y un filtro de emisión de 535 nm. Para evaluar la actividad de la luciferasa de Renilla, se determinó la luminiscencia total en muestras incubadas con 5 μm de coelenterazina. Para ambas mediciones, se calcularon las medias de los pocillos duplicados. Los valores de fluorescencia totales se dividieron luego por el fondo determinado en pocillos que contenían células no transfectadas. Los valores de fondo para la luminiscencia total fueron insignificantes y se restaron de los valores de la muestra. Titulación de proteínas de fusión donantes y aceptoras: los niveles de expresión de las construcciones mAChR-RLuc y mAChR-YFP se controlaron midiendo la luminiscencia y la fluorescencia, respectivamente, como se describió anteriormente. Este procedimiento se basa en observar que se ha encontrado que los niveles de luminiscencia y fluorescencia de varias proteínas de fusión receptor-RLuc y receptor-YFP (o receptor-GFP) se correlacionan linealmente con los números de receptores (18Ayoub M.A. Levoye A. Delagrange P. Jockers R. Mol. Pharmacol. 2004; 66: 312-321Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). Debido a que esta correlación es una propiedad intrínseca de cada proteína de fusión, probamos si nuestras proteínas de fusión mAChR seguían un patrón de correlación lineal. Por lo tanto, expresamos cada mAChR-RLuc o mAChR-YFP a diferentes niveles en células HEK 293 y evaluamos la relación entre la actividad de luciferasa o fluorescencia, respectivamente, y la cantidad de sitios de unión a mAChR en las mismas células. Treinta y seis horas después de la transfección, se incubaron ~20.000 células HEK 293 con [3H]QNB 1 nm en PBS, glucosa al 0,1% durante 90 min a 25 °C. La unión no específica se determinó en presencia de 1 μm de atropina. La reacción se detuvo mediante filtración rápida sobre filtros de fibra de vidrio GF/C, que luego se lavaron cuatro veces con PBS frío. La radiactividad retenida se determinó como se describió anteriormente. La luminiscencia y la fluorescencia (unidades arbitrarias) se graficaron contra los sitios de unión totales, y se obtuvieron curvas de regresión lineal (Fig. 2). Estas curvas estándar generadas para cada experimento individual se utilizaron para transformar los valores de fluorescencia y luminiscencia en femtomoles de receptor. Por lo tanto, las relaciones fluorescencia/luminiscencia se transformaron en relaciones (receptor-YFP)/(receptor-RLuc), lo que nos permitió determinar los valores precisos de BRETmax y BRET50 (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Se determinó la concentración de proteína de las muestras para controlar el número de células y también para expresar el número de receptores en femtomoles/mg de proteína celular total, utilizando el método estándar descrito por Lowry et al. (20 Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. Randall R.J. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Ensayos de regulación negativa del receptor: la determinación de la regulación negativa de mAChR M2 o M3 inducida por agonistas se logró utilizando la unión del ligando muscarínico permeable a la membrana [3H]QNB a células intactas que expresan cualquiera de los subtipos DE mAChR, como se describió anteriormente (21Schlador M.L. Grubbs R.D. Nathanson N.M.J. Biol. Chem. 2000; 275: 23295-23302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (33) Google Scholar). En resumen, las células JEG-3 se transfectaron transitoriamente con construcciones de ADN de mAChR M2 o FLAG-M3. Cuarenta y ocho horas después, las células se incubaron con carbacol 1 mm durante diferentes tiempos (dentro de un intervalo de 0-12 h) o en presencia de diversas concentraciones de carbacol durante 12 h a 37 °C. Las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y se marcaron con una concentración de saturación de [3H]QNB (~1 nm) en PBS durante 90 min a 37 °C. La unión no específica se determinó en presencia de 1 μm de atropina. Las células marcadas se lavaron con PBS enfriado con hielo y se filtraron en filtros de membrana GF/C (Whatman). A continuación, los filtros se lavaron con PBS enfriado con hielo, se transfirieron a viales de centelleo y se combinaron con fluido de centelleo antes de la determinación de la radiactividad mediante recuento de centelleo. La regulación negativa de las células mAChR-JEG-3 M2 y M3 coexpresadas se transfectó con mAChR M2, mAChR FLAG-M3 o ambas construcciones de ADN en diferentes proporciones siguiendo el procedimiento indicado anteriormente. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se trataron con carbacol de 10 μm durante 12 h a 37 °C. Luego, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo, se cosecharon en amortiguador de fosfato de sodio/potasio 50 mm, pH 7.4, complementado con inhibidores de proteasa (10 μg/ml de leupeptina, 70 μg/ml de fluoruro de fenilmetanosulfonilo y 0.25 μg/ml de pepstatina A), y se homogeneizaron con vidrio y vidrio. Las membranas se obtuvieron como se describió anteriormente (17Goin J.C. Nathanson N.M.J. Neurochem. 2002; 83: 964-972 Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar), y el número total de mAChR en homogeneizados de membrana brutos se determinó usando la unión de [3H]QNB como describen Halvorsen y Nathanson (22Halvorsen S.W. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1981; 256: 7941-7948Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Los números de mAChR M2 y FLAG-M3 se midieron mediante el ensayo DE inmunoprecipitación descrito anteriormente (23McKinnon L.A. Nathanson N.M.J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar) utilizando anticuerpos monoclonales anti-M2 y anti-FLAG, respectivamente. Alternativamente, los experimentos de control se realizaron mediante la cotransfección de células con mAChR FLAG-M3 y mAChR HA-M3 a diferentes niveles DE expresión relativa, según lo determinado por inmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-FLAG y anti-HA (23McKinnon L.A. Nathanson N.M.J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar). El grado de regulación negativa de FLAG-M3 después del tratamiento con carbacol se determinó como se indicó anteriormente. Análisis de datos: se analizaron las curvas de saturación bret utilizando el software Prism 4. Las isotermas se ajustaron utilizando una ecuación de regresión no lineal suponiendo un único sitio de unión, que proporcionó los valores BRETmax y BRET50. La correlación entre la fluorescencia o luminiscencia y la densidad del receptor se analizó mediante el ajuste de la curva de regresión lineal con el mismo software. La significación estadística de las diferencias en la regulación de mAChR de M2 frente a M3 se evaluó mediante la prueba t de Student no apareada de dos colas. La homo y heterodimerización de mAChR M1, M2 y M3 se evaluaron en células HEK 293 vivas mediante análisis BRET cuantitativo. Para este propósito, los tres subtipos de mAChR se fusionaron en su extremo C al donante de energía RLuc o al aceptor YFP. Para garantizar que las proteínas de fusión expresadas fueran polipéptidos plegados adecuadamente capaces de unirse a ligandos muscarínicos, evaluamos sus propiedades de unión mediante ensayos de unión por saturación utilizando el antagonista muscarínico [3H]QNB. El análisis detallado de los valores de Kd obtenidos de esas curvas de saturación (Tabla 1) indicó que las modificaciones en el extremo C de mAChR M1, M2 y M3 no alteraron significativamente la afinidad por el radioligando muscarínico en comparación con los receptores de tipo salvaje. En otro conjunto de experimentos, todas las construcciones se expresaron individualmente en células HEK 293, y la unión del ligando muscarínico impermeable a la membrana N-[3H]metilescopolamina se determinó en paralelo con la unión del antagonista muscarínico permeable a la membrana [3H]QNB a concentraciones de radioligando saturantes para cada receptor expresado. Debido a que no se encontraron diferencias significativas entre los niveles de unión de ambos radioligandos al mismo receptor, 4J. C. Goin y N. M. Nathanson, observaciones no publicadas. concluimos que todas las proteínas de fusión se expresan en la superficie celular y que dicha colocalización garantiza sus posibilidades de interactuar entre sí.TABLE 1Parámetros de unión de los constructos mAChR M1, M2 y M3ConstructKdpmM1 mAChR-RLuc13.7 ± 0.9M1 mAChR-YFP13.0 ± 0.7WT-M1 mAChR11.7 ± 2.0M2 mAChR-RLuc19.4 ± 2.0M2 mAChR-YFP24.6 ± 3.3WT-M2 mAChR24.0 ± 2.8M3 mAChR-RLuc38.6 ± 3.2M3 mAChR-YFP33.6 ± 4.2WT-M3 mAChR37.8 ± 2.5 Tabla abierta en una nueva pestaña Para determinar si M1, M2 y M3 mAChR pueden formar homodímeros en células intactas, evaluamos la capacidad de mAChR etiquetado con RLuc coexpresado y mAChR etiquetado con YFP para interactuar entre sí mediante el análisis de la curva de saturación de BRET. Las células HEK 293 se cotransfectaron transitoriamente con una cantidad constante de la construcción RLuc y cantidades crecientes de la construcción YFP, y la transferencia de energía entre ambas proteínas de fusión se midió tras la adición del sustrato de luciferasa de Renilla coelenterazina h. Los niveles de expresión de cada receptor etiquetado con RLuc se evaluaron mediante la detección de la luminiscencia total de la reacción de luciferasa previa, y los niveles de expresión de los receptores etiquetados con YFP se controlaron mediante la determinación de la fluorescencia total. Debido a que se encontró que los niveles de expresión de las construcciones de RLuc se modificaban mediante la cotransfección de cantidades crecientes de sus compañeros de YFP, las señales de BRET se graficaron en función de la relación fluorescencia/luminiscencia. La coexpresión de moléculas donantes M1, M2 o M3 con sus compañeros aceptores homólogos dio como resultado isotermas de saturación clásicas (Fig. 1, A–C), en el que las señales de BRET aumentaron como una función hiperbólica de la concentración del aceptor, alcanzando una asíntota que corresponde a la saturación de todos los donantes de BRET por moléculas aceptoras. Esta constatación sugiere que mAChR M1, M2 y M3 forman homodímeros constitutivos en células vivas. Para garantizar que estas señales de BRET no resultaran de una interacción espuria entre RLuc e YFP, realizamos ensayos de control en los que cada mAChR etiquetado con RLuc se coexpresó con cantidades crecientes de YFP soluble. Estos ensayos de saturación dieron como resultado curvas casi lineales que muestran señales marginales de BRET, lo que indica una interacción inespecífica entre ambos compañeros coexpresados en cada caso. La selectividad de la interacción entre mAChR donante y aceptor se evaluó adicionalmente para descartar la posibilidad de señales BRET inespecíficas debido a la sobreexpresión de proteínas transmembrana. El receptor de señalización de siete transmembranas distantemente relacionado Smoothened fusionado a YFP (Smo-YFP) se cotransfectó con mAChR-RLuc M1, M2 o M3, lo que dio como resultado una relación de BRET drásticamente disminuida para los tres mAChR probados. Por el contrario, la coexpresión de Smo-RLuc con cantidades crecientes de Smo-YFP produjo niveles de BRET significativamente más altos (Fig. 1 complementaria), lo que indica que Smo-RLuc es efectivamente capaz de formar dímeros constitutivos en células intactas cuando se coexpresa con un compañero específico. Los datos de BRET no se vieron influenciados por la posición relativa de RLuc o YFP en los pares de receptores porque se obtuvieron resultados idénticos para la orientación recíproca. 4J. C. Goin y N. M. Nathanson, inéditos. Estos datos confirman nuestra observación anterior, lo que indica que las proteínas de fusión donantes y aceptoras M1, M2 y M3 participan en interacciones específicas como homodímeros constitutivos. Aunque las curvas de saturación mostradas anteriormente sugieren que el donante y aceptor M1, M2 y M3 interactúan específicamente entre sí, no proporcionan suficiente información sobre los parámetros de unión necesarios para el análisis cuantitativo adecuado de las interacciones receptor-receptor. Por lo tanto, realizamos un nuevo conjunto de experimentos de saturación en los que se controló la cantidad de cada receptor expresado eficazmente en las células transfectadas, para cada experimento individual, correlacionando tanto la luminiscencia total como la fluorescencia total con el número de sitios de unión a [3H] QNB. El análisis de dicha correlación muestra una relación lineal entre la luminiscencia total y la densidad del receptor sin diferencias significativas entre las pendientes obtenidas para los tres subtipos de receptores mAChR (Fig. 2). El análisis de correlación entre la fluorescencia total y el número total de receptores también produjo curvas lineales. Sin embargo, la pendiente obtenida para M1-YFP fue significativamente mayor que la de M2-YFP o M3-YFP. Las ecuaciones de regresión lineal que se muestran en la Fig. 2 complementaria se utilizaron para transformar las unidades de fluorescencia y luminiscencia en números de receptores, y las señales de BRET se graficaron en función de la relación (número de receptor-YFP)/(número de receptor-RLuc). Estas nuevas curvas de saturación de BRET también se comportaron como funciones hiperbólicas alcanzando un nivel de saturación (Fig. 2). De acuerdo con el análisis clásico de la interacción proteína-proteína monitorizada por bret suponiendo un sitio de unión, la concentración del aceptor que proporciona el 50% de la transferencia de energía (BRET50) representa la afinidad relativa entre ambos protómeros que interactúan, y la señal máxima de BRET depende del número total de dímeros formados, así como de la distancia entre el donante y el aceptor dentro del dímero (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Al comparar las curvas obtenidas para los homodímeros de mAChR M1, M2 y M3 (Tabla 2), no se encontraron diferencias significativas en los valores de BRET50, lo que indica que las afinidades de los protómeros entre sí son similares entre los tres subtipos de mAChR estudiados. Por otro lado, se encontró que el valor de BRETmax para el par donante-aceptor M1 era significativamente diferente del de los homodímeros M2 y M3. De hecho, el BRETmax para el par M1-RLuc/M1-YFP fue más del doble que los otros valores de BRETmax. Esto podría indicar que un mayor porcentaje del subtipo M1 participa en la homodimerización o que la transferencia de energía entre RLuc y YFP dentro del homodímero M1 es más eficiente que la de los homodímeros M2 y M3. Debido a que se encontró que las afinidades relativas entre cada uno de los socios eran muy similares entre los tres subtipos de receptores (Tabla 2), la segunda hipótesis es más probable. Además, el hecho de que las curvas de correlación entre la fluorescencia total y la densidad del receptor produjeran un valor de pendiente más alto para M1 sugiere que YFP funciona como un aceptor más eficiente cuando se fusiona con el subtipo de receptor M1, lo que puede resultar en valores de BRET más altos para este par.TABLE 2Homodimerización de M1, M2 y M3 mAChR; parámetros de las curvas de saturación de BretPair transfectadoBRETmaxBRET50% de los receptores existentes como dímerosM1-RLuc/M1-YFP0.285 ± 0.0071.83 ± 0.1472 ± 4M2-RLuc/M2-YFP0.139 ± 0.0041.70 ± 0.2378 ± 8M3-RLuc/M3-YFP0.128 ± 0.0031.41 ± 0.1383 ± 6 Tabla abierta en una nueva pestaña Para evaluar la naturaleza de los homo-oligómeros de M1, M2 y M3 mAChR (24Veatch W. Stryer L. Mol. Biol. 1977; 113: 89-102Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar). Esta fórmula describe la probabilidad de formar complejos competentes para bret en función del tamaño oligomérico del receptor (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Las curvas experimentales se ajustan mejor a la curva teórica predicha para un dímero en lugar de las esperadas para un trímero o tetrámero, lo que sugiere que la fracción oligomérica de las poblaciones de mAChR M1, M2 o M3 está compuesta predominantemente por complejos diméricos (Fig. 3). Análisis cuantitativo detallado de la homodimerización del receptor β2-adrenérgico por Mercier et al. (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar) sugirieron que es posible estimar la proporción de receptores involucrados en la dimerización. Suponiendo un equilibrio libre entre las proteínas de fusión donante y aceptor, se espera que solo el 50% de los dímeros generen BRET si ambas parejas se expresan a concentraciones equimolares, porque cada pareja también puede generar un 25% de homodímeros entre moléculas idénticas. Although previous pharmacological and biochemical data support the notion that muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) form homo- and heterodimers, the existence of mAChR oligomers in live cells is still a matter of controversy. Here we used bioluminescence resonance energy transfer to demonstrate that M1, M2, and M3 mAChR can form constitutive homo- and heterodimers in living HEK 293 cells. Quantitative bioluminescence resonance energy transfer analysis has revealed that the cell receptor population in cells expressing a single subtype of M1, M2, or M3 mAChR is predominantly composed of high affinity homodimers. Saturation curve analysis of cells expressing two receptor subtypes demonstrates the existence of high affinity M1/M2, M2/M3, and M1/M3 mAChR heterodimers, although the relative affinity values were slightly lower than those for mAChR homodimers. Short term agonist treatment did not modify the oligomeric status of homo- and heterodimers. When expressed in JEG-3 cells, the M2 receptor exhibits much higher susceptibility than the M3 receptor to agonist-induced down-regulation. Coexpression of M3 mAChR with increasing amounts of the M2 subtype in JEG-3 cells resulted in an increased agonist-induced down-regulation of M3, suggesting a novel role of heterodimerization in the mechanism of mAChR long term regulation. Although previous pharmacological and biochemical data support the notion that muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) form homo- and heterodimers, the existence of mAChR oligomers in live cells is still a matter of controversy. Here we used bioluminescence resonance energy transfer to demonstrate that M1, M2, and M3 mAChR can form constitutive homo- and heterodimers in living HEK 293 cells. Quantitative bioluminescence resonance energy transfer analysis has revealed that the cell receptor population in cells expressing a single subtype of M1, M2, or M3 mAChR is predominantly composed of high affinity homodimers. Saturation curve analysis of cells expressing two receptor subtypes demonstrates the existence of high affinity M1/M2, M2/M3, and M1/M3 mAChR heterodimers, although the relative affinity values were slightly lower than those for mAChR homodimers. Short term agonist treatment did not modify the oligomeric status of homo- and heterodimers. When expressed in JEG-3 cells, the M2 receptor exhibits much higher susceptibility than the M3 receptor to agonist-induced down-regulation. Coexpression of M3 mAChR with increasing amounts of the M2 subtype in JEG-3 cells resulted in an increased agonist-induced down-regulation of M3, suggesting a novel role of heterodimerization in the mechanism of mAChR long term regulation. Over the last decade, many studies have shown broad evidence that G protein-coupled receptors (GPCR) 3The abbreviations used are: GPCR, G protein-coupled receptor; mAChR, muscarinic acetylcholine receptor; TMD, transmembrane domain; BRET, bioluminescence resonance energy transfer; RLuc, Renilla luciferase; YFP, yellow fluorescence protein, GFP, green fluorescence protein; Smo, smoothened; QNB, quinuclidinyl benzilate; i3, third intracellular loop; PBS, phosphate-buffered saline; HA, hemagglutinin. interact with one another to form constitutive homo- or hetero-oligomers. GPCR dimerization has been implicated in many aspects of receptor pharmacology, such as maturation, ligand binding, activation, signaling, desensitization, endocytosis, and trafficking (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 3Breitwieser G.E. Circ. Res. 2004; 94: 17-27Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). In the early 1990s, several studies showed that muscarinic acetylcholine receptors (mAChR), like other GPCR, might be arranged in dimeric or oligomeric complexes. Complex binding curves for both muscarinic agonists and antagonists were interpreted as evidence for the existence of multiple states of affinity, which is consistent with the notion of binding sites located on dimeric receptor molecules (4Hirschberg B.T. Schimerlik M.I. J. Biol. Chem. 1994; 269: 26127-26135Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 5Potter L.T. Ballesteros L.A. Bichajian L.H. Ferrendelli C.A. Fisher A. Hanchett H.E. Zhang R. Mol. Pharmacol. 1991; 39: 211-221PubMed Google Scholar). More recent studies on mAChR have shown that such heterogeneity of affinity should rather be attributed to nucleotide-sensitive cooperative effects between interacting sites (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992; 31: 10908-10921Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar, 7Chidiac P. Green M.A. Pawagi A.B. Wells J.W. Biochemistry. 1997; 36: 7361-7379Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar). Because there seems to be one binding site per receptor molecule, cooperativity suggests that mAChR are actually oligomers formed by two or more interacting sites (6Chidiac P. Wells J.W. Biochemistry. 1992; 31: 10908-10921Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar). Additional pharmacological evidence that mAChR can form dimers was provided by Maggio et al. (8Maggio R. Vogel Z. Wess J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 3103-3107Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar), who used chimeric α2-adrenergic/M3 muscarinic receptors composed of the first five transmembrane domains (TMD) of one receptor and the last two TMD of the other. No binding or signaling was detected when either fusion protein was expressed alone, but coexpression of both chimeras rescued binding activity and signaling properties of both adrenergic and muscarinic ligands. These results were interpreted as intermolecular interactions between two inactive receptors now engaged in a dimeric complex with restored receptor functional properties. However, such trans-complementation results have been challenged because of the fact that those intermolecular interactions were seen by studying mutant receptors and not wild type receptors (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). Coimmunoprecipitation of solubilized epitope-tagged M3 mAChR and Western blot analysis has also been employed to demonstrate the existence of mAChR oligomers in a direct fashion. This biochemical approach revealed that the M3 mAChR is capable of forming disulfide-linked as well as noncovalent dimers/multimers (9Zeng F.Y. Wess J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 19487-19497Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (215) Google Scholar). Although coimmunoprecipitation/immunoblotting assays provide fairly convincing evidence for mAChR dimer formation, such studies have been criticized for the possibility that the observed receptor aggregation could result from an artifact because of the presence of concentrated preparations of highly hydrophobic molecules following the solubilization process (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). Over the last decade, several groups have used biophysical assays based on light resonance energy transfer to assess GPCR oligomerization (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar, 11Angers S. Salahpour A. Joly E. Hilairet S. Chelsky D. Dennis M. Bouvier M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 3684-3689PubMed Google Scholar). Fluorescence resonance energy transfer and its variation, bioluminescence resonance energy transfer (BRET), have been used extensively to overcome technological limitations present in pharmacological and biochemical methods because they have the distinct advantage of monitoring real time interactions between proteins synthesized in their correct location in living cells (10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004; 24: 254-278Crossref Scopus (84) Google Scholar). In the classical BRET methodology, the first protein is fused to Renilla luciferase (RLuc), and the second protein partner is fused to a fluorescent protein (yellow fluorescent protein (YFP)). If both partners interact, resonance energy transfer between RLuc (donor) and the YFP (acceptor) can be measured upon addition of the RLuc substrate coelenterazine (12Xu Y. Piston D.W. Johnson C.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 151-156Crossref PubMed Scopus (507) Google Scholar). In this study, the occurrence of constitutive homo- and hetero-oligomers among M1, M2, and M3 mAChR was investigated in living cells expressing physiological levels of these receptors by BRET. BRET saturation experiments were conducted to estimate the relative ability of each receptor subtype to engage in homo- and heterotropic interactions. The nature of such homo-oligomers, the proportion of receptor molecules forming those oligomeric complexes, and the effect of muscarinic agonist on M1, M2, and M3 mAChR homo- and heterodimerization were also addressed. Finally, we examined the implications of oligomerization on mAChR function by determining the effect of M2/M3 heterodimerization on agonist-induced M3 mAChR regulation. Materials—[3H]Quinuclidinyl benzilate ([3H]QNB, 42 Ci/mmol) and N-[3H]methylscopolamine (81 Ci/mmol) were purchased from Amersham Biosciences. Dulbecco's modified Eagle's medium, penicillin/streptomycin, and fetal bovine serum were purchased from Invitrogen. Restriction enzymes were from New England Biolabs (Beverly, MA), and coelenterazine h was obtained from Promega (Madison, WI). The anti-HA polyclonal antibody (HA.11) was purchased from Covance (Berkeley, CA). Carbamylcholine chloride (carbachol), atropine sulfate, anti-FLAG M2 monoclonal antibody, and all other reagents were purchased from Sigma. The monoclonal antibody against the porcine cardiac M2 mAChR was generated and characterized by Luetje et al. (13Luetje C.W. Brumwell C. Norman M.G. Peterson G.L. Schimerlik M.I. Nathanson N.M. Biochemistry. 1987; 26: 6892-6896Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Receptor Constructs—mAChR-RLuc and mAChR-YFP fusion proteins were constructed by ligating the Renilla luciferase (RLuc) and the YFP moieties to the C-terminal end of the receptors. Mouse M1, porcine M2, and human M3 mAChR coding sequences without their stop codons were amplified by using sense and antisense primers harboring unique restriction sites. The fragments were then subcloned in-frame into pRL-CMV-RLuc (Promega) or pEYFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA). Restriction sites used were as follows: XhoI/BamHI (M1-RLuc, M1-YFP), XhoI/SacII (M2-RLuc, M2-YFP), EcoRV/BamHI (M3-RLuc), and EcoRI/BamHI (M3-YFP). pEYFP was cut with AgeI and BsrGI, and the YFP fragment was inserted into the AgeI/BsrGI site from human Smoothened-GFP (Smo-GFP) to give Smo-YFP. Smo-GFP was provided by Dr. A. Kaykas (University of Washington). The HA-M3 mAChR expression plasmid was obtained from University of Missouri-Rolla cDNA Resource Center (Rolla, MO). All other constructs have been described elsewhere (14Nadler L.S. Kumar G. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 2001; 276: 10539-10547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar, 15Kaykas A. Yang-Snyder J. Héroux M. Shah K.V. Bouvier M. Moon R.T. Nat. Cell Biol. 2004; 6: 52-58Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). Cell Culture and Transfection—HEK 293 or JEG-3 cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum and penicillin (100 units/ml)/streptomycin sulfate (0.1 mg/ml) at 37 °C in a humidified 10% CO2 environment. Transient transfections were performed on cells that were at 70–80% confluence using the calcium phosphate precipitation protocol (16Mellon P. Parker V. Gluzman Y. Maniatis T. Cell. 1981; 27: 279-288Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (335) Google Scholar). Pharmacological Characterization of Constructs—HEK 293 cells grown in 15-cm dishes were transfected with RLuc-tagged, YFP-tagged, or nontagged mAChR (12.5-25 μg of DNA/plate). Following a 36-h period post-transfection, cells were washed with ice-cold PBS, and membranes were obtained as described previously (17Goin J.C. Nathanson N.M. J. Neurochem. 2002; 83: 964-972Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar). Saturation binding studies were performed by incubating membranes with increasing concentrations of [3H]QNB at 37 °C for 90 min in 50 mm sodium/potassium phosphate, pH 7.4. Atropine (1 μm) was used to define nonspecific binding. The reaction was stopped by rapid filtration over GF/C glass-fiber filters (Whatman). Filters were then washed four times with cold phosphate buffer, and the retained radioactivity was determined by scintillation counting. Curves were analyzed by nonlinear regression analysis using Prism 4 software (GraphPad, San Diego). BRET Assays—Thirty six hours after transfection, HEK 293 cells were distributed in 96-well microplates (white opaque Isoplate, Wallac) washed with phosphate-buffered saline (PBS) and resuspended in PBS/glucose 0.1% in the presence or absence of 10 μm carbachol at 25 °C. Coelenterazine h was added at a final concentration of 5 μm, and light intensity was sequentially integrated in the 510–590 and 440–500 nm windows using a Victor2 multiplate reader (PerkinElmer Life Sciences). BRET ratio was defined as ((emission at 510–590)/(emission at 440–500)) – Cf, where Cf corresponded to (emission at 510–590)/(emission at 440–500) for the receptor RLuc constructs expressed alone in the same experiments. Fluorescence and Luminescence Measurements—Transiently transfected HEK 293 cells were harvested, washed, and resuspended as described above and then distributed in 96-well microplates (either clear-bottomed or white opaque Isoplates for fluorescence and luminescence determinations, respectively). Both determinations were also carried out in a Victor2 multiplate reader. The total fluorescence of cells was measured using an excitation filter of 485 nm and an emission filter of 535 nm. For assessing the activity of Renilla luciferase, total luminescence was determined on samples incubated with 5 μm coelenterazine. For both measurements, the means of duplicate wells were calculated. Total fluorescence values were then divided by the background determined in wells containing untransfected cells. The background values for total luminescence were negligible, and they were subtracted from sample values. Titration of Donor and Acceptor Fusion Proteins—Expression levels of mAChR-RLuc and mAChR-YFP constructs were monitored by measuring luminescence and fluorescence, respectively, as described above. This procedure is based on the observation that luminescence and fluorescence levels of several receptor-RLuc and receptor-YFP (or receptor-GFP) fusion proteins have been found to be linearly correlated with receptor numbers (18Ayoub M.A. Levoye A. Delagrange P. Jockers R. Mol. Pharmacol. 2004; 66: 312-321Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). Because this correlation is an intrinsic property of each fusion protein, we tested whether our mAChR fusion proteins followed a linear correlation pattern. Thus, we expressed each mAChR-RLuc or mAChR-YFP at different levels in HEK 293 cells and assessed the relationship between luciferase activity or fluorescence, respectively, and the amount of mAChR-binding sites in the same cells. Thirty six hours after transfection, ∼20,000 HEK 293 cells were incubated with 1 nm [3H]QNB in PBS, 0.1% glucose for 90 min at 25 °C. Nonspecific binding was determined in the presence of 1 μm atropine. The reaction was stopped by rapid filtration over GF/C glass-fiber filters, which were then washed four times with cold PBS. Retained radioactivity was determined as described above. Luminescence and fluorescence (arbitrary units) were plotted against total binding sites, and linear regression curves were obtained (supplemental Fig. 2). These standard curves generated for each single experiment were used to transform fluorescence and luminescence values into femtomoles of receptor. Thus, the fluorescence/luminescence ratios were transformed into (receptor-YFP)/(receptor-RLuc) ratios, which allowed us to determine accurate BRETmax and BRET50 values (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). Protein concentration of samples was determined to control for the number of cells and also to express receptor numbers in femtomole/mg of total cell protein, using the standard method described by Lowry et al. (20Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. Randall R.J. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Receptor Down-regulation Assays—Determination of agonist-induced M2 or M3 mAChR down-regulation was accomplished using the binding of the membrane-permeable muscarinic ligand [3H]QNB to intact cells expressing either mAChR subtype, as described previously (21Schlador M.L. Grubbs R.D. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 2000; 275: 23295-23302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (33) Google Scholar). Briefly, JEG-3 cells were transiently transfected with either M2 or FLAG-M3 mAChR DNA constructs. Forty eight hours later cells were incubated either with 1 mm carbachol for different times (within a 0–12-h-range) or in the presence of various concentrations of carbachol for 12 h at 37 °C. Cells were then washed with ice-cold PBS and labeled with a saturating concentration of [3H]QNB (∼1 nm) in PBS for 90 min at 37 °C. Nonspecific binding was determined in the presence of 1 μm atropine. Labeled cells were washed with ice-cold PBS and filtered onto GF/C membrane filters (Whatman). Filters were then washed with ice-cold PBS, transferred to scintillation vials, and combined with scintillation fluid before the determination of radioactivity by scintillation counting. Down-regulation of Coexpressed M2 and M3 mAChR—JEG-3 cells were transfected with M2 mAChR, FLAG-M3 mAChR, or both DNA constructs at different proportions following the procedure indicated above. Forty eight hours post-transfection, cells were treated with 10 μm carbachol for 12 h at 37 °C. Cells were then washed with ice-cold PBS, harvested in 50 mm sodium/potassium phosphate buffer, pH 7.4, supplemented with protease inhibitors (10 μg/ml leupeptin, 70 μg/ml phenylmethanesulfonyl fluoride, and 0.25 μg/ml pepstatin A), and were glass-glass homogenized. Membranes were obtained as described previously (17Goin J.C. Nathanson N.M. J. Neurochem. 2002; 83: 964-972Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar), and the total number of mAChR in crude membrane homogenates was determined using the binding of [3H]QNB as described by Halvorsen and Nathanson (22Halvorsen S.W. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1981; 256: 7941-7948Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The numbers of M2 and FLAG-M3 mAChR were measured by the immunoprecipitation assay described previously (23McKinnon L.A. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar) using anti-M2 and anti-FLAG monoclonal antibodies, respectively. Alternatively, control experiments were performed by cotransfecting cells with FLAG-M3 mAChR and HA-M3 mAChR at different relative expression levels, as determined by immunoprecipitation using anti-FLAG and anti-HA antibodies (23McKinnon L.A. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar). The extent of FLAG-M3 down-regulation after carbachol treatment was then determined as indicated above. Data Analysis—BRET saturation curves were analyzed using Prism 4 software. Isotherms were fitted using a nonlinear regression equation assuming a single binding site, which provided BRETmax and BRET50 values. The correlation between fluorescence or luminescence and receptor density was analyzed by linear regression curve fitting with the same software. Statistical significance of differences in M2 versus M3 mAChR regulation was assessed by the two-tailed unpaired Student's t test. Homo- and heterodimerization of M1, M2, and M3 mAChR were assessed in live HEK 293 cells by quantitative BRET analysis. For this purpose, the three mAChR subtypes were fused at their C terminus to the energy donor RLuc or the acceptor YFP. To ensure that the expressed fusion proteins were properly folded polypeptides capable of binding muscarinic ligands, we assessed their binding properties by saturation binding assays using the muscarinic antagonist [3H]QNB. Detailed analysis of the Kd values obtained from those saturation curves (Table 1) indicated that the modifications at the C terminus of M1, M2, and M3 mAChR did not significantly alter the affinity for the muscarinic radioligand as compared with the wild type receptors. In another set of experiments, all constructs were individually expressed in HEK 293 cells, and the binding of the membrane-impermeable muscarinic ligand N-[3H]methylscopolamine was determined in parallel with the binding of the membrane-permeable muscarinic antagonist [3H]QNB at saturating radioligand concentrations for each receptor expressed. Because no significant difference was found between the binding levels of both radioligands to the same receptor, 4J. C. Goin and N. M. Nathanson, unpublished observations. we concluded that all fusion proteins are expressed at the cell surface and that such colocalization ensures their chances of interacting with each other.TABLE 1Binding parameters of M1, M2, and M3 mAChR constructsConstructKdpmM1 mAChR-RLuc13.7 ± 0.9M1 mAChR-YFP13.0 ± 0.7WT-M1 mAChR11.7 ± 2.0M2 mAChR-RLuc19.4 ± 2.0M2 mAChR-YFP24.6 ± 3.3WT-M2 mAChR24.0 ± 2.8M3 mAChR-RLuc38.6 ± 3.2M3 mAChR-YFP33.6 ± 4.2WT-M3 mAChR37.8 ± 2.5 Open table in a new tab To determine whether M1, M2, and M3 mAChR can form homodimers in intact cells, we assessed the ability of coexpressed RLuc-tagged mAChR and YFP-tagged mAChR to interact with one another by BRET saturation curve analysis. HEK 293 cells were transiently cotransfected with a constant amount of the RLuc construct and increasing amounts of the YFP construct, and the transfer of energy between both fusion proteins was measured upon addition of the Renilla luciferase substrate coelenterazine h. The expression levels of each RLuc-tagged receptor were assessed by detection of total luminescence from the previous luciferase reaction, and the expression levels of the YFP-tagged receptors were monitored by determination of total fluorescence. Because the expression levels of RLuc constructs were found to be modified by the cotransfection of increasing amounts of their YFP partners, BRET signals were plotted as a function of the fluorescence/luminescence ratio. Coexpression of M1, M2, or M3 donor molecules with their homologous acceptor partners resulted in classical saturation isotherms (Fig. 1, A–C), in which BRET signals increased as a hyperbolic function of the concentration of the acceptor, reaching an asymptote that corresponds to the saturation of all BRET donors by acceptor molecules. This observation suggests that M1, M2, and M3 mAChR form constitutive homodimers in live cells. To ensure that these BRET signals did not result from a spurious interaction between RLuc and YFP, we performed control assays in which each RLuc-tagged mAChR was coexpressed with increasing amounts of soluble YFP. These saturation assays resulted in quasi-linear curves showing marginal BRET signals, which indicate a nonspecific interaction between both coexpressed partners in each case. The selectivity of the interaction between donor and acceptor mAChR was further assessed to rule out the possibility of nonspecific BRET signals because of transmembrane protein overexpression. The distantly related seven transmembrane signaling receptor Smoothened fused to YFP (Smo-YFP) was cotransfected with M1, M2, or M3 mAChR-RLuc, which resulted in a dramatically decreased BRET ratio for the three mAChR tested. In contrast, coexpression of Smo-RLuc with increasing amounts of Smo-YFP yielded significantly higher BRET levels (supplemental Fig. 1), indicating that Smo-RLuc is effectively capable of forming constitutive dimers in intact cells when coexpressed with a specific partner. BRET data were not influenced by the relative position of RLuc or YFP on the receptor pairs because identical results were obtained for the reciprocal orientation. 4J. C. Goin and N. M. Nathanson, unpublished observations. These data confirm our previous observation, indicating that M1, M2, and M3 donor and acceptor fusion proteins are engaged in specific interactions as constitutive homodimers. Although the saturation curves shown previously suggest that M1, M2, and M3 donor and acceptor specifically interact with each other, they do not provide enough information about the binding parameters required for proper quantitative analysis of receptor-receptor interactions. Therefore, we conducted a new set of saturation experiments in which the amount of each receptor effectively expressed in transfected cells was monitored, for each individual experiment, by correlating both total luminescence and total fluorescence with the number of [3H]QNB-binding sites. The analysis of such correlation shows a linear relationship between total luminescence and receptor density with no significant differences among the slopes obtained for the three mAChR receptor subtypes (supplemental Fig. 2). Correlation analysis between total fluorescence and total receptor numbers also yielded linear curves. However, the slope obtained for M1-YFP was significantly higher than that from either M2-YFP or M3-YFP. The linear regression equations shown in supplemental Fig. 2 were used to transform fluorescence and luminescence units to receptor numbers, and BRET signals were plotted as a function of (receptor-YFP number)/(receptor-RLuc number) ratio. These new BRET saturation curves also behaved as hyperbolic functions reaching a saturation level (Fig. 2). According to classical analysis of BRET-monitored protein-protein interaction assuming one binding site, the concentration of the acceptor giving 50% of the energy transfer (BRET50) accounts for the relative affinity between both interacting protomers, and the maximal BRET signal depends on the total number of dimers formed as well as on the distance between the donor and the acceptor within the dimer (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). When comparing the curves obtained for M1, M2, and M3 mAChR homodimers (Table 2), no significant differences in BRET50 values were found, indicating that the affinities of protomers for one another are similar among the three mAChR subtypes studied. On the other hand the BRETmax value for the M1 donor-acceptor pair was found to be significantly different from that for M2 and M3 homodimers. Indeed, the BRETmax for the M1-RLuc/M1-YFP pair was over twice as high as the other BRETmax values. This could indicate that either a higher percentage of the M1 subtype is engaged in homodimerization or that energy transfer between RLuc and YFP within the M1 homodimer is more efficient than that for M2 and M3 homodimers. Because the relative affinities between each of the partners were found to be very similar among the three receptor subtypes (Table 2), the second hypothesis is more likely. Moreover, the fact that correlation curves between total fluorescence and receptor density yielded a higher slope value for M1 suggests that YFP functions as a more efficient acceptor when it is fused to the M1 receptor subtype, which may result in higher BRET values for this pair.TABLE 2Homodimerization of M1, M2, and M3 mAChR; parameters from BRET saturation curvesPair transfectedBRETmaxBRET50% of receptors existing as dimersM1-RLuc/M1-YFP0.285 ± 0.0071.83 ± 0.1472 ± 4M2-RLuc/M2-YFP0.139 ± 0.0041.70 ± 0.2378 ± 8M3-RLuc/M3-YFP0.128 ± 0.0031.41 ± 0.1383 ± 6 Open table in a new tab To assess the nature of M1, M2, and M3 mAChR homo-oligomers, we compared their corresponding experimental saturation curves (Fig. 2) with the expected ones for dimeric, trimeric, and tetrameric complexes using a modification of the equation by Veatch and Stryer (24Veatch W. Stryer L. J. Mol. Biol. 1977; 113: 89-102Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar). This formula describes the probability of forming BRET-competent complexes as a function of the oligomeric size of the receptor (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar). The experimental curves fit better to the theoretical curve predicted for a dimer rather than those expected for a trimer or tetramer, suggesting that the oligomeric fraction of M1, M2, or M3 mAChR populations is predominantly composed of dimeric complexes (Fig. 3). Detailed quantitative analysis of β2-adrenergic receptor homodimerization by Mercier et al. (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar) suggested that it is possible to estimate the proportion of receptors engaged in dimerization. Assuming a free equilibrium between donor and acceptor fusion proteins, only 50% of the dimers are expected to generate BRET if both partners are expressed at equimolar concentrations, because each partner can also generate 25% homodimers between identical molecules. على الرغم من أن البيانات الدوائية والكيميائية الحيوية السابقة تدعم فكرة أن مستقبلات أسيتيل كولين المسكارينية (mAChR) تشكل متجانسات وغير متجانسة، إلا أن وجود أوليغومرات mAChR في الخلايا الحية لا يزال موضع جدل. استخدمنا هنا نقل طاقة رنين التلألؤ الحيوي لإثبات أن M1 و M2 و M3 mAChR يمكن أن تشكل مثبطات متجانسة وغير متجانسة في خلايا HEK الحية 293. كشف تحليل نقل طاقة الرنين الحيوي الكمي أن مجموعة مستقبلات الخلايا في الخلايا التي تعبر عن نوع فرعي واحد من M1 أو M2 أو M3 mAChR تتكون في الغالب من متجانسات تقارب عالية. يوضح تحليل منحنى التشبع للخلايا التي تعبر عن نوعين فرعيين من المستقبلات وجود متغايرات M1/M2 و M2/M3 و M1/M3 mAChR عالية التقارب، على الرغم من أن قيم التقارب النسبية كانت أقل قليلاً من قيم المتجانسات mAChR. لم يغير العلاج الناهض قصير المدى حالة القلة المتجانسة وغير المتجانسة. عند التعبير عنه في خلايا JEG -3، يُظهر مستقبل M2 قابلية أعلى بكثير من مستقبل M3 للتنظيم السفلي المستحث بالمواد المساعدة. أدى التعبير المشترك عن M3 mAChR مع كميات متزايدة من النوع الفرعي M2 في خلايا JEG -3 إلى زيادة التنظيم السفلي المستحث بالمواد المساعدة لـ M3، مما يشير إلى دور جديد للثنائية غير المتجانسة في آلية التنظيم طويل المدى لـ mAChR. على الرغم من أن البيانات الدوائية والكيميائية الحيوية السابقة تدعم فكرة أن مستقبلات أسيتيل كولين المسكارينية (mAChR) تشكل متجانسات وغير متجانسة، إلا أن وجود أوليغومرات mAChR في الخلايا الحية لا يزال موضع جدل. استخدمنا هنا نقل طاقة رنين التلألؤ الحيوي لإثبات أن M1 و M2 و M3 mAChR يمكن أن تشكل مثبطات متجانسة وغير متجانسة في خلايا HEK الحية 293. كشف تحليل نقل طاقة الرنين الحيوي الكمي أن مجموعة مستقبلات الخلايا في الخلايا التي تعبر عن نوع فرعي واحد من M1 أو M2 أو M3 mAChR تتكون في الغالب من متجانسات تقارب عالية. يوضح تحليل منحنى التشبع للخلايا التي تعبر عن نوعين فرعيين من المستقبلات وجود متغايرات M1/M2 و M2/M3 و M1/M3 mAChR عالية التقارب، على الرغم من أن قيم التقارب النسبية كانت أقل قليلاً من قيم المتجانسات mAChR. لم يغير العلاج الناهض قصير المدى حالة القلة المتجانسة وغير المتجانسة. عند التعبير عنه في خلايا JEG -3، يُظهر مستقبل M2 قابلية أعلى بكثير من مستقبل M3 للتنظيم السفلي المستحث بالمواد المساعدة. أدى التعبير المشترك عن M3 mAChR مع كميات متزايدة من النوع الفرعي M2 في خلايا JEG -3 إلى زيادة التنظيم السفلي المستحث بالمواد المساعدة لـ M3، مما يشير إلى دور جديد للثنائية غير المتجانسة في آلية التنظيم طويل المدى لـ mAChR. على مدى العقد الماضي، أظهرت العديد من الدراسات أدلة واسعة على أن مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCR) 3 الاختصارات المستخدمة هي: GPCR، مستقبل G المقترنة بالبروتين ؛ mAChR، مستقبل أسيتيل كولين المسكاريني ؛ TMD، المجال عبر الغشاء ؛ BRET، نقل طاقة رنين التلألؤ الحيوي ؛ RLuc، Renilla luciferase ؛ YFP، بروتين مضان أصفر، GFP، بروتين مضان أخضر ؛ Smo، smoothened ؛ QNB، quinuclidinyl benzilate ؛ i3، الحلقة الثالثة داخل الخلايا ؛ PBS، محلول ملحي مخفف بالفوسفات ؛ HA، هيماجلوتينين. تتفاعل مع بعضها البعض لتشكيل أقطاب متجانس أو غير متجانس. وقد تورطت ثنائية GPCR في العديد من جوانب علم الأدوية المستقبلة، مثل النضج، وربط الرابطة، والتنشيط، والإشارات، وإزالة الحساسية، والإلتقام، والاتجار (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286 Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435 Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 3Breitwieser G.E. Circ. Res. 2004; 94: 17-27 Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). في أوائل التسعينيات، أظهرت العديد من الدراسات أن مستقبلات أسيتيل كولين المسكارينية (mAChR)، مثل GPCR الأخرى، قد يتم ترتيبها في مجمعات ثنائية أو قليلة القسيمات. تم تفسير منحنيات الربط المعقدة لكل من ناهضات المسكارين والمضادات كدليل على وجود حالات متعددة من التقارب، والتي تتفق مع مفهوم مواقع الربط الموجودة على جزيئات المستقبلات الثنائية (4Hirschberg B.T. Schimerlik M.I. J. Biol. Chem. 1994; 269: 26127-26135Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 5Potter L.T. Ballesteros L.A. Bichajian L.H. Ferrendelli C.A. Fisher A. Hanchett H.E. Zhang R. Mol. Pharmacol. 1991 ؛ 39: 211-221 PubMed الباحث العلمي من Google). أظهرت الدراسات الحديثة حول mAChR أن مثل هذا التباين في التقارب يجب أن يُعزى بدلاً من ذلك إلى التأثيرات التعاونية الحساسة للنيوكليوتيدات بين المواقع المتفاعلة (6Chidiac P. Wells JW Biochemistry. 1992 ؛ 31: 10908-10921 Crossref PubMed Scopus (39) الباحث العلمي من Google، 7Chidiac P. Green M.A. Pawagi AB Wells JW Biochemistry. 1997 ؛ 36: 7361-7379 Crossref PubMed Scopus (96) الباحث العلمي من Google). نظرًا لأنه يبدو أن هناك موقع ربط واحد لكل جزيء مستقبل، فإن التعاون يشير إلى أن mAChR هي في الواقع أوليغومرات تتكون من موقعين متفاعلين أو أكثر (6Chidiac P. Wells JW Biochemistry. 1992 ؛ 31: 10908-10921 Crossref PubMed Scopus (39) الباحث العلمي من Google). تم تقديم أدلة دوائية إضافية على أن mAChR يمكن أن يشكل dimers بواسطة Maggio et al. (8Maggio R. Vogel Z. Wess J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993 ؛ 90: 3103-3107 Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar)، الذي استخدم مستقبلات مسكارينية خيالية α 2 - adrenergic/M3 تتكون من المجالات الخمسة الأولى عبر الغشاء (TMD) لمستقبل واحد وآخر اثنين من TMD من الآخر. لم يتم الكشف عن أي ارتباط أو إشارة عند التعبير عن أي من بروتينات الاندماج بمفردها، ولكن التعبير المشترك لكل من الكميرات أنقذ نشاط الارتباط وخصائص الإشارة لكل من الروابط الأدرينالية والمسكارينية. تم تفسير هذه النتائج على أنها تفاعلات بين الجزيئات بين مستقبلين غير نشطين ينخرطان الآن في مركب ثنائي الأبعاد مع خصائص وظيفية للمستقبلات المستعادة. ومع ذلك، فقد تم تحدي نتائج التكامل هذه بسبب حقيقة أن هذه التفاعلات بين الجزيئات شوهدت من خلال دراسة مستقبلات الطفرة وليس مستقبلات النوع البري (1Bouvier M. Nat. مراجعة Neurosci. 2001 ؛ 2: 274-286 Crossref PubMed Scopus (582) الباحث العلمي من Google). كما تم استخدام الترسيب المشترك للحاتمة الموسومة M3 mAChR وتحليل البقعة الغربية لإثبات وجود أوليغومرات mAChR بطريقة مباشرة. كشف هذا النهج الكيميائي الحيوي أن M3 mAChR قادر على تكوين ثنائيات الكبريتيد المرتبطة وكذلك ثنائيات/متعددة التكافؤ (9Zeng FY Wess JJ Biol. كيم. 1999 ؛ 274: 19487-19497 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (215) الباحث العلمي من Google). على الرغم من أن فحوصات الترسيب المناعي/التكتل المناعي تقدم دليلًا مقنعًا إلى حد ما على تكوين دايمر mAChR، فقد تم انتقاد مثل هذه الدراسات لاحتمال أن يكون تراكم المستقبلات المرصود ناتجًا عن قطعة أثرية بسبب وجود مستحضرات مركزة لجزيئات مسعور للغاية بعد عملية الذوبان (1Bouvier M. Nat. مراجعة Neurosci. 2001 ؛ 2: 274-286 Crossref PubMed Scopus (582) الباحث العلمي من Google). على مدى العقد الماضي، استخدمت عدة مجموعات المقايسات الفيزيائية الحيوية بناءً على نقل طاقة رنين الضوء لتقييم تقزيم GPCR (1Bouvier M. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 274-286 Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar, 2Angers S. Salahpour A. Bouvier M. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 409-435 Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004; 24: 254-278 Crossref Scopus (84) Google Scholar, 11Angers S. Salahpour A. Joly E. Hilairet S. Chelsky D. Dennis M. Bouvier M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000 ؛ 97: 3684-3689 PubMed Google Scholar). تم استخدام نقل طاقة رنين الفلورة وتغيرها، نقل طاقة رنين التألق الحيوي (BRET)، على نطاق واسع للتغلب على القيود التكنولوجية الموجودة في الطرق الدوائية والكيميائية الحيوية لأنها تتمتع بميزة واضحة تتمثل في مراقبة التفاعلات في الوقت الفعلي بين البروتينات المركبة في موقعها الصحيح في الخلايا الحية (10Kroeger K.M. Pfleger K.D.G. Eidne K.A. Front. Neuroendocrinol. 2004 ؛ 24: 254-278 Crossref Scopus (84) Google Scholar). في منهجية بريت الكلاسيكية، يتم دمج البروتين الأول مع لوسيفيراز رينيلا (RLuc)، ويتم دمج شريك البروتين الثاني مع بروتين فلوري (بروتين فلوري أصفر (YFP)). إذا تفاعل كلا الشريكين، يمكن قياس نقل طاقة الرنين بين RLuc (المانح) و YFP (المستقبل) عند إضافة RLuc الركيزة coelenterazine (12Xu Y. Piston D.W. Johnson C.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999 ؛ 96: 151-156 Crossref PubMed Scopus (507) Google Scholar). في هذه الدراسة، تم التحقيق في حدوث متجانسات متجانسة وغير متجانسة بين M1 و M2 و M3 mAChR في الخلايا الحية التي تعبر عن المستويات الفسيولوجية لهذه المستقبلات بواسطة بريت. أجريت تجارب تشبع بريت لتقدير القدرة النسبية لكل نوع فرعي من المستقبلات على الانخراط في تفاعلات متجانسة وغير متجانسة. كما تم تناول طبيعة هذه المتجانسات، ونسبة جزيئات المستقبلات التي تشكل تلك المجمعات القلة، وتأثير ناهض المسكارين على M1 و M2 و M3 mAChR homo - و heterodimerization. أخيرًا، درسنا آثار القلة على وظيفة mAChR من خلال تحديد تأثير M2/M3 heterodimerization على تنظيم M3 mAChR المستحث بالمواد المساعدة. المواد - [3H] تم شراء Quinuclidinyl benzilate ([3H]QNB، 42 Ci/mmol) و N -[3H] methylscopolamine (81 Ci/mmol) من Amersham Biosciences. تم شراء وسيط Eagle المعدل من Dulbecco، البنسلين/الستربتومايسين، ومصل الأبقار الجنيني من Invitrogen. كانت إنزيمات التقييد من مختبرات نيو إنجلاند الحيوية (بيفرلي، ماساتشوستس)، وتم الحصول على كولينتيرازين h من بروميجا (ماديسون، ويسكونسن). تم شراء الجسم المضاد متعدد النسائل المضاد لـ HA (HA.11) من كوفانس (بيركلي، كاليفورنيا). تم شراء كلوريد الكرباميل كولين (كرباكول)، وكبريتات الأتروبين، والجسم المضاد أحادي النسيلة M2 المضاد لـ FLAG، وجميع الكواشف الأخرى من Sigma. تم إنشاء الجسم المضاد أحادي النسيلة ضد M2 mAChR القلبي للخنازير وتميز به Luetje et al. (13Luetje C.W. Brumwell C. Norman M.G. Peterson G.L. Schimerlik M.I. Nathanson N.M. الكيمياء الحيوية. 1987 ؛ 26: 6892-6896 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). تم بناء بروتينات الانصهار mAChR - RLuc و mAChR - YFP عن طريق ربط رينيلا لوسيفيراز (RLuc) وشظايا YFP بالطرف C من المستقبلات. تم تضخيم تسلسلات ترميز mAChR للفأر M1 والخنزير M2 والبشر M3 بدون رموز التوقف الخاصة بهم باستخدام المواد التمهيدية الحساسة والمضادة للإحساس التي تحتوي على مواقع تقييد فريدة. ثم تم استنساخ الشظايا في الإطار الفرعي إلى pRL - CMV - RLuc (Promega) أو pEYFP - N1 (Clontech، Palo Alto، CA). كانت مواقع التقييد المستخدمة على النحو التالي: XhoI/BamHI (M1 - RLuc، M1 - YFP)، XhoI/SacII (M2 - RLuc، M2 - YFP)، EcoRV/BamHI (M3 - RLuc)، و EcoRI/BamHI (M3 - YFP). تم قطع pEYFP مع AgeI و BsrGI، وتم إدخال جزء YFP في موقع AgeI/BsrGI من Smo - GFP البشري (Smo - GFP) لإعطاء Smo - YFP. تم توفير Smo - GFP من قبل الدكتور أ. كايكاس (جامعة واشنطن). تم الحصول على بلازميد تعبير HA - M3 mAChR من مركز موارد الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين بجامعة ميسوري- رولا (رولا، ميزوري). تم وصف جميع التركيبات الأخرى في مكان آخر (14Nadler LS Kumar G. Nathanson NM J. Biol. Chem. 2001; 276: 10539-10547 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar, 15Kaykas A. Yang - Snder J. Héroux M. Shah K.V. Bouvier M. Moon R.T.Nat. Cell Biol. 2004; 6: 52-58 Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). زراعة الخلايا وانتقالها - نمت خلايا HeK 293 أو JEG -3 في وسط النسر المعدل في دولبيكو مع 10 ٪ (حجم/حجم) من مصل الأبقار الجنيني والبنسلين (100 وحدة/مل)/ستربتومايسين سلفات (0.1 ملغ/مل) عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة بنسبة 10 ٪ من ثاني أكسيد الكربون. تم إجراء عمليات نقل عابرة على الخلايا التي كانت عند التقاء 70-80 ٪ باستخدام بروتوكول ترسيب فوسفات الكالسيوم (16Mellon P. Parker V. Gluzman Y. Maniatis T. Cell. 1981 ؛ 27: 279-288 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (335) الباحث العلمي من Google). التوصيف الدوائي للبنيات - تم نقل 293 خلية نمت في أطباق 15 سم مع RLuc - tagged، YFP - tagged، أو غير الموسومة mAChR (12.5-25 ميكروغرام من الحمض النووي/لوحة). بعد فترة 36 ساعة بعد العدوى، تم غسل الخلايا بـ PBS المثلج، وتم الحصول على الأغشية كما هو موضح سابقًا (17Goin JC Nathanson NMJ Neurochem. 2002 ؛ 83: 964-972 Crossref PubMed Scopus (9) الباحث العلمي من Google). تم إجراء دراسات ربط التشبع عن طريق احتضان الأغشية بتركيزات متزايدة من [3H]QNB عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في 50 مم من فوسفات الصوديوم/البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4. تم استخدام الأتروبين (1 ميكرومتر) لتحديد الارتباط غير المحدد. تم إيقاف التفاعل عن طريق الترشيح السريع فوق مرشحات الألياف الزجاجية GF/C (Whatman). ثم تم غسل المرشحات أربع مرات باستخدام عازل الفوسفات البارد، وتم تحديد النشاط الإشعاعي المحتفظ به عن طريق عد الوميض. تم تحليل المنحنيات من خلال تحليل الانحدار غير الخطي باستخدام برنامج Prism 4 (GraphPad، San Diego). فحوصات بريت - بعد ست وثلاثين ساعة من انتقال العدوى، تم توزيع خلايا HEK 293 في ألواح دقيقة مكونة من 96 بئرًا (إيزوبليت أبيض معتم، والاك) مغسولة بمحلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) وأعيد تعليقها في PBS/جلوكوز 0.1 ٪ في وجود أو عدم وجود 10 ميكرومتر من الكرباكول عند 25 درجة مئوية. تمت إضافة Coelenterazine h بتركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر، وتم دمج شدة الضوء بالتتابع في النوافذ 510–590 و 440–500 نانومتر باستخدام قارئ Victor2 المضاعف (PerkinElmer Life Sciences). تم تعريف نسبة بريت على أنها ((انبعاث عند 510-590)/(انبعاث عند 440–500)) – راجع، حيث يتوافق Cf مع (انبعاث عند 510-590)/(انبعاث عند 440–500) لبنيات مستقبلات RLuc المعبر عنها بمفردها في نفس التجارب. قياسات التألق والتألق - تم حصاد خلايا HEK 293 المصابة مؤقتًا وغسلها وإعادة تعليقها كما هو موضح أعلاه ثم توزيعها في ألواح دقيقة بسعة 96 بئرًا (إما ذات قاع شفاف أو بيضاء معتمة لتحديد التألق والتألق، على التوالي). تم تنفيذ كلا القرارين أيضًا في قارئ فيكتور 2 المضاعف. تم قياس الفلورة الكلية للخلايا باستخدام مرشح استثارة قدره 485 نانومتر ومرشح انبعاث قدره 535 نانومتر. لتقييم نشاط رينيلا لوسيفيراز، تم تحديد التألق الكلي على العينات المحتضنة بـ 5 ميكرومتر من الكويلينتيرازين. بالنسبة لكلا القياسين، تم حساب وسائل الآبار المكررة. ثم قسمت قيم الفلورة الإجمالية على الخلفية المحددة في الآبار التي تحتوي على خلايا غير منقولة. كانت قيم الخلفية للتلألؤ الكلي ضئيلة، وتم طرحها من قيم العينة. تمت مراقبة معايرة بروتينات الانصهار المانحة والمقبولة - مستويات التعبير عن بنيات mAChR - RLuc و mAChR - YFP عن طريق قياس التألق والتألق، على التوالي، كما هو موضح أعلاه. يعتمد هذا الإجراء على ملاحظة أن مستويات التألق والفلورة للعديد من بروتينات اندماج مستقبلات RLuc ومستقبلات YFP (أو مستقبلات GFP) قد وجد أنها مرتبطة خطيًا بأرقام المستقبلات (18Ayoub MA Levoye A. Delagrange P. Jockers R. Mol. Pharmacol. 2004; 66: 312-321 Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). نظرًا لأن هذا الارتباط هو خاصية جوهرية لكل بروتين اندماجي، فقد اختبرنا ما إذا كانت بروتينات اندماج mAChR تتبع نمط ارتباط خطي. وهكذا، عبرنا عن كل mAChR - RLuc أو mAChR - YFP على مستويات مختلفة في خلايا HEK 293 وقمنا بتقييم العلاقة بين نشاط اللوسيفراز أو الفلورة، على التوالي، وكمية مواقع ربط mAChR في نفس الخلايا. بعد ست وثلاثين ساعة من نقل العدوى، تم تحضين 20000 خلية HEK 293 مع 1 نانومتر [3H]QNB في PBS، 0.1 ٪ جلوكوز لمدة 90 دقيقة عند 25 درجة مئوية. تم تحديد الارتباط غير المحدد في وجود أتروبين 1 ميكرومتر. تم إيقاف التفاعل عن طريق الترشيح السريع على مرشحات الألياف الزجاجية GF/C، والتي تم غسلها بعد ذلك أربع مرات باستخدام PBS البارد. تم تحديد النشاط الإشعاعي المحتجز كما هو موضح أعلاه. تم رسم اللمعان والفلورة (الوحدات العشوائية) مقابل مواقع الربط الإجمالية، وتم الحصول على منحنيات الانحدار الخطي (الشكل التكميلي. 2). تم استخدام هذه المنحنيات القياسية التي تم إنشاؤها لكل تجربة واحدة لتحويل قيم التألق والتألق إلى فيمتومولات مستقبلات. وهكذا، تم تحويل نسب التألق/التلألؤ إلى نسب (مستقبل- YFP)/(مستقبل- RLuc)، مما سمح لنا بتحديد قيم BRETmax و BRET50 الدقيقة (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. كيم. 2002 ؛ 277: 44925-44931 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (422) الباحث العلمي من Google). تم تحديد تركيز البروتين للعينات للتحكم في عدد الخلايا وأيضًا للتعبير عن أرقام المستقبلات في الفيمتومول/ملغ من إجمالي بروتين الخلية، باستخدام الطريقة القياسية التي وصفها لوري وآخرون. (20 Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. Randall R.J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275 Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). فحوصات تنظيم خفض المستقبلات - تم تحديد تنظيم خفض M2 أو M3 mAChR المستحث بالمؤثرات باستخدام ربط الرباط المسكاريني المنفذ للغشاء [3H]QNB بالخلايا السليمة التي تعبر عن النوع الفرعي mAChR، كما هو موضح سابقًا (21Schlador M.L. Grubbs R.D. Nathanson N.M. J. Biol. كيم. 2000 ؛ 275: 23295-23302 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (33) الباحث العلمي من Google). باختصار، تم نقل خلايا JEG -3 بشكل عابر إما باستخدام بنيات الحمض النووي M2 أو FLAG - M3 mAChR. بعد ثمان وأربعين ساعة تم تحضين الخلايا إما بكرباكول 1 مم لأوقات مختلفة (ضمن نطاق 0-12 - h) أو في وجود تركيزات مختلفة من الكرباكول لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم تم غسل الخلايا بـ PBS المثلج وتم تصنيفها بتركيز مشبع قدره [3H]QNB (1 نانومتر) في PBS لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم تحديد الارتباط غير المحدد في وجود أتروبين 1 ميكرومتر. تم غسل الخلايا الملصقة بالجليد البارد PBS وترشيحها على مرشحات غشاء GF/C (Whatman). ثم تم غسل المرشحات باستخدام PBS البارد، ونقلها إلى قوارير التلألؤ، ودمجها مع سائل التلألؤ قبل تحديد النشاط الإشعاعي عن طريق عد التلألؤ. تم نقل تنظيم خلايا M2 و M3 mAChR - JEG -3 المعبر عنها مع M2 mAChR أو FLAG - M3 mAChR أو كل من تركيبات الحمض النووي بنسب مختلفة باتباع الإجراء المشار إليه أعلاه. بعد ثمان وأربعين ساعة من العدوى، عولجت الخلايا بكرباكول 10 ميكرومتر لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم تم غسل الخلايا باستخدام PBS المثلج، وتم حصادها في محلول صوديوم/فوسفات البوتاسيوم 50 مم، ودرجة الحموضة 7.4، واستكملت بمثبطات الأنزيم البروتيني (10 ميكروغرام/مل من اللوبيبتين، و 70 ميكروغرام/مل من فلوريد فينيل ميثان سلفونيل، و 0.25 ميكروغرام/مل من بيبستاتين أ)، وتم تجنيس الزجاج. تم الحصول على الأغشية كما هو موضح سابقًا (17Goin JC Nathanson NMJ Neurochem. 2002 ؛ 83: 964-972 Crossref PubMed Scopus (9) Google Scholar)، وتم تحديد العدد الإجمالي لـ mAChR في متجانسات الغشاء الخام باستخدام ربط [3H]QNB كما وصفه Halvorsen و Nathanson (22Halvorsen S.W. Nathanson N.M. J. Biol. Chem. 1981; 256: 7941-7948 Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). تم قياس أعداد M2 و FLAG - M3 mAChR بواسطة اختبار الترسيب المناعي الموصوف سابقًا (23McKinnon L.A. Nathanson N.M.J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar) باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ M2 و FLAG، على التوالي. بدلاً من ذلك، تم إجراء تجارب التحكم بواسطة خلايا نقل مشتركة مع FLAG - M3 mAChR و HA - M3 mAChR عند مستويات تعبير نسبي مختلفة، على النحو الذي يحدده الترسيب المناعي باستخدام الأجسام المضادة لـ FLAG والأجسام المضادة لـ HA (23McKinnon L.A. Nathanson n.M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 20636-20642Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (50) Google Scholar). ثم تم تحديد مدى انخفاض تنظيم FLAG - M3 بعد علاج الكرباكول كما هو موضح أعلاه. تحليل البيانات - تم تحليل منحنيات تشبع BRET باستخدام برنامج Prism 4. تم تركيب متساوي الحرارة باستخدام معادلة انحدار غير خطية بافتراض موقع ربط واحد، والذي قدم قيم BRETmax و BRET50. تم تحليل العلاقة بين التألق أو التألق وكثافة المستقبلات من خلال منحنى الانحدار الخطي المناسب مع نفس البرنامج. تم تقييم الأهمية الإحصائية للاختلافات في تنظيم M2 مقابل M3 mAChR من خلال اختبار t غير المقترن ثنائي الذيل للطالب. تم تقييم المضاعفة المتجانسة وغير المتجانسة لـ M1 و M2 و M3 mAChR في خلايا HEK الحية 293 من خلال تحليل بريت الكمي. لهذا الغرض، تم دمج الأنواع الفرعية الثلاثة لـ mAChR في الطرف C الخاص بها إلى RLuc المانح للطاقة أو YFP المتقبل. للتأكد من أن بروتينات الانصهار المعبر عنها عبارة عن عديد ببتيدات مطوية بشكل صحيح وقادرة على ربط الروابط المسكارينية، قمنا بتقييم خصائص ربطها عن طريق فحوصات ربط التشبع باستخدام مضاد المسكارين [3H]QNB. أشار التحليل التفصيلي لقيم Kd التي تم الحصول عليها من منحنيات التشبع هذه (الجدول 1) إلى أن التعديلات عند الطرف C لـ M1 و M2 و M3 mAChR لم تغير بشكل كبير من تقارب المادة المشعة المسكارينية مقارنة بمستقبلات النوع البري. في مجموعة أخرى من التجارب، تم التعبير عن جميع التركيبات بشكل فردي في خلايا HEK 293، وتم تحديد ارتباط الرابطة المسكارينية غير المنفذة للغشاء N -[3H] ميثيلسكوبولامين بالتوازي مع ربط المضاد المسكاريني المنفذ للغشاء [3H]QNB بتركيزات رابطة إشعاعية مشبعة لكل مستقبل معبر عنه. لأنه لم يتم العثور على فرق كبير بين مستويات الارتباط لكل من الروابط المشعة لنفس المستقبل، 4J. C. Goin و N. M. Nathanson، ملاحظات غير منشورة. خلصنا إلى أن جميع بروتينات الاندماج يتم التعبير عنها على سطح الخلية وأن مثل هذا التوطين يضمن فرصها في التفاعل مع بعضها البعض. TABLE 1 معلمات الربط لـ M1 و M2 و M3 mAChR constructsConstructKdpmM1 mAChR - RLuc13.7 ± 0.9M1 mAChR - YFP13.0 ± 0.7WT-M1 mAChR11.7 ± 2.0M2 mAChR - RLuc19.4 ± 2.0M2 mAChR - YFP24.6 ± 3.3WT-M2 mAChR24.0 ± 2.8M3 mAChR - RLuc38.6 ± 3.2M3 mAChR - YFP33.6 ± 4.2WT-M3 mAChR37.8 ± 2.5 جدول مفتوح في علامة تبويب جديدة لتحديد ما إذا كان بإمكان M1 و M2 و M3 mAChR تشكيل متجانسات في الخلايا السليمة، قمنا بتقييم قدرة mAChR المعبر عنها و YAChR - taghR على التفاعل مع واحد آخر من خلال تحليل منحنى Breturation. تم نقل خلايا HEK 293 بشكل عابر مع كمية ثابتة من بنية RLuc وكميات متزايدة من بنية YFP، وتم قياس نقل الطاقة بين كل من بروتينات الاندماج عند إضافة رينيلا لوسيفيراز الركيزة coelenterazine h. تم تقييم مستويات التعبير لكل مستقبل محدد بعلامة RLuc من خلال الكشف عن التألق الكلي من تفاعل لوسيفيراز السابق، وتمت مراقبة مستويات التعبير للمستقبلات المحددة بعلامة YFP من خلال تحديد التألق الكلي. نظرًا لأنه تم العثور على تعديل مستويات التعبير عن بنيات RLuc من خلال النقل المشترك لكميات متزايدة من شركائهم في YFP، فقد تم رسم إشارات BRET كدالة لنسبة التألق/التلألؤ. أدى التعبير المشترك للجزيئات المانحة M1 أو M2 أو M3 مع شركائها المتقبلين المتماثلين إلى تشبع متساوي الحرارة كلاسيكيًا (الشكل 1، A - C)، حيث زادت إشارات بريت كدالة زائدة لتركيز المستقبل، لتصل إلى خط التقارب الذي يتوافق مع تشبع جميع متبرعي بريت بواسطة جزيئات المستقبل. تشير هذه الملاحظة إلى أن M1 و M2 و M3 mAChR تشكل مثبطات متجانسة تكوينية في الخلايا الحية. للتأكد من أن إشارات BRET هذه لم تنتج عن تفاعل زائف بين RLuc و YFP، أجرينا فحوصات تحكم تم فيها التعبير عن كل mAChR موسوم بـ RLuc بكميات متزايدة من YFP القابلة للذوبان. أدت فحوصات التشبع هذه إلى منحنيات شبه خطية تظهر إشارات بريت هامشية، والتي تشير إلى تفاعل غير محدد بين كلا الشريكين المعبر عنهما في كل حالة. كما تم تقييم انتقائية التفاعل بين المتبرع والمستقبل mAChR لاستبعاد إمكانية إشارات BRET غير المحددة بسبب التعبير المفرط للبروتين عبر الغشاء. تم نقل مستقبلات الإشارات السبعة عبر الغشاء ذات الصلة البعيدة المنصهرة إلى YFP (Smo - YFP) مع M1 أو M2 أو M3 mAChR - RLuc، مما أدى إلى انخفاض كبير في نسبة BRET لثلاثة mAChR تم اختبارها. في المقابل، أدى التعبير المشترك لـ Smo - RLuc مع كميات متزايدة من Smo - YFP إلى مستويات BRET أعلى بكثير (الشكل التكميلي 1)، مما يشير إلى أن Smo - RLuc قادر بشكل فعال على تكوين أبعاد تأسيسية في خلايا سليمة عند التعبير المشترك مع شريك معين. لم تتأثر بيانات بريت بالموقف النسبي لـ RLuc أو YFP على أزواج المستقبلات لأنه تم الحصول على نتائج متطابقة للتوجه المتبادل. 4J. C. Goin and N. M. Nathanson، ملاحظات غير منشورة. تؤكد هذه البيانات ملاحظتنا السابقة، مما يشير إلى أن بروتينات الانصهار المانحة والمتقبلة M1 و M2 و M3 تشارك في تفاعلات محددة كمتجانسات تأسيسية. على الرغم من أن منحنيات التشبع الموضحة سابقًا تشير إلى أن المتبرع والمستقبل M1 و M2 و M3 يتفاعلان على وجه التحديد مع بعضهما البعض، إلا أنهما لا يوفران معلومات كافية حول معلمات الربط المطلوبة للتحليل الكمي المناسب لتفاعلات المستقبلات والمستقبلات. لذلك، أجرينا مجموعة جديدة من تجارب التشبع التي تم فيها مراقبة كمية كل مستقبل معبر عنها بشكل فعال في الخلايا المنقولة بالعدوى، لكل تجربة فردية، من خلال ربط كل من التألق الكلي والفلورة الكلية بعدد [3H] مواقع ربط QNB. يُظهر تحليل هذا الارتباط علاقة خطية بين اللمعان الكلي وكثافة المستقبلات مع عدم وجود اختلافات كبيرة بين المنحدرات التي تم الحصول عليها للأنواع الفرعية الثلاثة لمستقبلات mAChR (الشكل التكميلي. 2). أدى تحليل الارتباط بين الفلورة الإجمالية وأرقام المستقبلات الإجمالية أيضًا إلى منحنيات خطية. ومع ذلك، كان المنحدر الذي تم الحصول عليه لـ M1 - YFP أعلى بكثير من ذلك من M2 - YFP أو M3 - YFP. تم استخدام معادلات الانحدار الخطي الموضحة في الشكل التكميلي 2 لتحويل وحدات التألق والتلألؤ إلى أرقام مستقبلات، وتم رسم إشارات بريت كدالة لنسبة (رقم المستقبل- YFP)/(رقم المستقبل- RLuc). كما تصرفت منحنيات تشبع بريت الجديدة هذه كوظائف زائدة تصل إلى مستوى تشبع (الشكل 2). وفقًا للتحليل الكلاسيكي لتفاعل البروتين والبروتين الخاضع لمراقبة BRET بافتراض موقع ربط واحد، فإن تركيز المستقبل الذي يعطي 50 ٪ من نقل الطاقة (BRET50) يمثل التقارب النسبي بين كل من البروتومرات المتفاعلة، وتعتمد إشارة بريت القصوى على العدد الإجمالي للثنائي المتكون وكذلك على المسافة بين المانح والمقبل داخل الدايمر (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. كيم. 2002 ؛ 277: 44925-44931 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (422) الباحث العلمي من Google). عند مقارنة المنحنيات التي تم الحصول عليها من المتجانسات M1 و M2 و M3 mAChR (الجدول 2)، لم يتم العثور على اختلافات كبيرة في قيم BRET50، مما يشير إلى أن تقارب البروتومرات لبعضها البعض متشابهة بين الأنواع الفرعية الثلاثة mAChR التي تمت دراستها. من ناحية أخرى، وجد أن قيمة BRETmax لزوج مستقبلات المتبرع M1 تختلف اختلافًا كبيرًا عن قيمة M2 و M3 homodimers. في الواقع، كان BRETmax لزوج M1 - RLuc/M1 - YFP أعلى بمرتين من قيم BRETmax الأخرى. يمكن أن يشير هذا إلى أن إما نسبة أعلى من النوع الفرعي M1 تعمل في الميمرة المتجانسة أو أن نقل الطاقة بين RLuc و YFP داخل الميمرة المتجانسة M1 أكثر كفاءة من الميمرات المتجانسة M2 و M3. نظرًا لأن التقارب النسبي بين كل من الشركاء وجد أنه متشابه جدًا بين الأنواع الفرعية الثلاثة للمستقبلات (الجدول 2)، فإن الفرضية الثانية أكثر احتمالًا. علاوة على ذلك، فإن حقيقة أن منحنيات الارتباط بين إجمالي الفلورة وكثافة المستقبل أسفرت عن قيمة انحدار أعلى لـ M1 تشير إلى أن YFP يعمل كمستقبل أكثر كفاءة عندما يندمج مع النوع الفرعي لمستقبل M1، مما قد يؤدي إلى قيم BRET أعلى لهذا الزوج. TABLE 2 تجانس M1 و M2 و M3 mAChR ؛ المعلمات من منحنيات تشبع BretPair transfectedBRETmaxBRET50 ٪ من المستقبلات الموجودة كـ dimersM1 - RLuc/M1-YFP0.285 ± 0.0071.83 ± 0.1472 ± 4M2 - RLuc/M2 - YFP0.139 ± 0.0041.70 ± 0.2378 ± 8M3 - RLuc/M3-YFP0.128 ± 0.0031.41 ± 0.1383 ± 6 جدول مفتوح في علامة تبويب جديدة لتقييم طبيعة M1 و M2 و M3 mAChR - homigolers، قمنا بمقارنة منحنيات التشبع المقابلة لها. (الشكل 2) مع تلك المتوقعة، الأبعاد، ثلاثية الأبعاد، والتعقيدات الثلاثية باستخدام المعادلات من المعادلة بواسطة VeerVry (W. بيول. 1977 ؛ 113: 89-102 Crossref PubMed Scopus (174) الباحث العلمي من Google). تصف هذه الصيغة احتمال تشكيل مجمعات مؤهلة لـ BRET كدالة لحجم القسيمات للمستقبل (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier M. J. Biol. كيم. 2002 ؛ 277: 44925-44931 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (422) الباحث العلمي من Google). تتناسب المنحنيات التجريبية بشكل أفضل مع المنحنى النظري المتوقع للثنائي بدلاً من تلك المتوقعة للثنائي أو الرباعي، مما يشير إلى أن الجزء الأوليغومري من مجموعات M1 أو M2 أو M3 mAChR يتكون في الغالب من معقدات ثنائية الأبعاد (الشكل 3). تحليل كمي مفصل لمستقبلات المستقبلات الأدرينالية بيتا 2 من قبل مرسييه وآخرون. (19Mercier J.F. Salahpour A. Angers S. Breit A. Bouvier MJ Biol. Chem. 2002; 277: 44925-44931 اقترح Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (422) Google Scholar) أنه من الممكن تقدير نسبة المستقبلات المشاركة في ثنائية الأبعاد. بافتراض وجود توازن حر بين بروتينات الانصهار المانحة والمتقبلة، من المتوقع أن يولد 50 ٪ فقط من الدايمرات بريت إذا تم التعبير عن كلا الشريكين بتركيزات متساوية، لأن كل شريك يمكنه أيضًا توليد 25 ٪ من المتجانسات بين جزيئات متطابقة.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Journal of Biologica...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Journal of Biological Chemistry
    Article . 2006 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Journal of Biological Chemistry
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    https://dx.doi.org/10.60692/0y...
    Other literature type . 2006
    Data sources: Datacite
    https://dx.doi.org/10.60692/d0...
    Other literature type . 2006
    Data sources: Datacite
    82
    citations82
    popularityTop 10%
    influenceTop 10%
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ Journal of Biologica...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Journal of Biological Chemistry
      Article . 2006 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Journal of Biological Chemistry
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      https://dx.doi.org/10.60692/0y...
      Other literature type . 2006
      Data sources: Datacite
      https://dx.doi.org/10.60692/d0...
      Other literature type . 2006
      Data sources: Datacite
  • image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Authors: Clark W. Bird; Glenna J. Chavez; Megan J. Barber; C. Fernando Valenzuela;

    ABSTRACTPrenatal ethanol exposure causes a variety of cognitive deficits that have a persistent impact on quality of life, some of which may be explained by ethanol-induced alterations in interneuron function. Studies from several laboratories, including our own, have demonstrated that a single binge-like ethanol exposure during the equivalent to the third trimester of human pregnancy leads to acute apoptosis and long-term loss of interneurons in the rodent retrosplenial cortex (RSC). The RSC is interconnected with the hippocampus, thalamus, and other neocortical regions and plays distinct roles in visuospatial processing and storage, as well as retrieval of hippocampal-dependent episodic memories. Here we used slice electrophysiology to characterize the acute effects of ethanol on GABAergic neurotransmission in the RSC of neonatal mice, as well as the long-term effects of neonatal ethanol exposure on parvalbumin-interneuron mediated neurotransmission in adolescent mice. Mice were exposed to ethanol using vapor inhalation chambers. In postnatal day (P) 7 mouse pups, ethanol unexpectedly failed to potentiate GABAAreceptor-mediated synaptic transmission. Binge-like ethanol exposure of P7 mice expressing channel rhodopsin in parvalbumin-positive interneurons enhanced the peak amplitudes, asynchronous activity and total charge, while decreasing the rise-times of optically-evoked GABAAreceptor-mediated inhibitory postsynaptic currents in adolescent animals. These effects could partially explain the learning and memory deficits that have been documented in adolescent and young adult mice exposed to ethanol during the third trimester-equivalent developmental period.

    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ https://europepmc.or...arrow_drop_down
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    https://europepmc.org/articles...
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Scientific Reports
    Article . 2021 . Peer-reviewed
    License: CC BY
    Data sources: Crossref
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Scientific Reports
    Article
    License: CC BY
    Data sources: UnpayWall
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    Scientific Reports
    Article . 2021
    Data sources: DOAJ
    image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
    image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao
    Access Routes
    Green
    gold
    9
    citations9
    popularityTop 10%
    influenceAverage
    impulseTop 10%
    BIP!Powered by BIP!
    more_vert
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/ https://europepmc.or...arrow_drop_down
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      https://europepmc.org/articles...
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Scientific Reports
      Article . 2021 . Peer-reviewed
      License: CC BY
      Data sources: Crossref
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Scientific Reports
      Article
      License: CC BY
      Data sources: UnpayWall
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      Scientific Reports
      Article . 2021
      Data sources: DOAJ
      image/svg+xml art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos Open Access logo, converted into svg, designed by PLoS. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Access_logo_PLoS_white.svg art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina, Beao, JakobVoss, and AnonMoos http://www.plos.org/
      image/svg+xml Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao Closed Access logo, derived from PLoS Open Access logo. This version with transparent background. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Closed_Access_logo_transparent.svg Jakob Voss, based on art designer at PLoS, modified by Wikipedia users Nina and Beao