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Les grandes caractéristiques hydrobiologiques du bassin de Marennes-Oléron sont définies par quatre campagnes saisonnières de 120 prélèvements chacune effectuée-, en 15 stations en demi-cycle de marée. Les salinités y fluctuent de 10 '/rr. et ce secteur peut donc être assimilé à un vaste estuaire contrôlé principalement par les apports fluviaux de la Charente. La turbidité reste élevée souvent supérieure à 100 mg.I"', les teneurs en oxygène dissous montrent un déficit en amont de la Charente et de la Seudre de 4 mg.L1 tandis que les sels nutritifs sont apportés par la Charente pour les nitrates, phosphates et silicates. Ces derniers suivent les courbes de dilution théorique excepté lors des poussées phytoplanctoniques et lors des crues hivernales. Lors de ces crues, les nitrates semblent soit apportés par la Gironde, soit dus à une minéralisation organique. Au même moment, les phosphates pourraient être absorbés sur les particules et être piégés dans les sédiments. Les biomasses phytoplanctoniques exprimées par les teneurs en chlorophylle a sont supésieures à 30 f^-g.1 ' en amont des estuaires au printemps avec des teneurs en phéopigmenls pouvants dépasser 200 IUJ.1 . par contre, dans le bassin, les teneurs ne dépassent guère 10 fig.l ''. Les concentrations en ATP montrent que peu de phytoplancton est physiologiquement actif en particulier dans les estuaires, tandis que les dosages de protéines permettent de quantifier la part des apports allochtone - par rapport à la production autochtone des estuaires. Line analyse factorielle des correspondances définit le schéma général hydrobiologique du bassin estuarien en précisant que 'e rôle de la Charente ne se limite pas à l'apport en sels minéraux azotés et phosphatés, mais aussi à l'apport d'une biomasse phytoplanctonique d'eau douce en voie de dégénérescence. Les auteurs proposent qu'une nouvelle stratégie d'échantillonnage, mieux adaptée aux objectifs recherchés, soit suivie ultérieurement en assurant des prélèvements en cycle de marée mais avec une périodicité la plus élevée possible. Four seasonal compaigns providing a sampling of 15 stations each followed during half a tide cycle, i.e. 120 water samples permit the definition of the main hydrobiological features of Marennes-Oleron Bay: salinity and turbidity, phytoplanktonic biomasses, ATP concentrations. The authors suggest that a new way of adapted sampling to their objectives, will work out in the future by sampling during tidal cycles but as frequently as possible.

When it comes to sustainable development, n-butanol production by biological means represents an environmentally friendly alternative compared to petrochemical means. Some organisms are able to produce butanol naturally, such as the Clostridiae family, which are Gram-positive bacteria, growing in strict anaerobic conditions. They produce butanol in mixture with acetone and ethanol, which reduce the production yield of butanol and increase the purification costs. In 2015, the PEEP team of TBI built a genetically modified strain of E. coli, expressing the complete conversion pathway from pyruvate to butanol from C. acetobutylicum. This strain’s metabolism was built so that the growth and glucose consumption speeds are coupled with the butanol production speed. In strict anaerobic growth in batch culture, in a chemically defined medium based on glucose and supplemented with yeast extracts (YE) and nitrate (NO3-), this strain produces 3,3 g/L of n-butanol, with a yield of 0,23 g butanol/g glucose, among other minority coproducts (succinate, lactate, acetate, butyrate). These coproducts lower the butanol production yield, and remain unexpected, because the corresponding metabolic pathways were deleted. The goal of this PhD project consists in identifying the metabolic pathways involved in the coproducts production and improving the understanding of the strain, in order to optimize it, improve the butanol/glucose yield, and simplify the culture medium. Several aspects are considered: expressing ferredoxin NAD(P)+ oxidoreductases (FNOR) from organisms other than C. acetobutylicum, in order to combine the reoxidation of the reduced ferredoxin to the generation of ATP; ii) inactivating the metabolic pathways from E. coli which may be involved in the coproducts synthesis; iii) performing an evolutionary in-vivo adaptation of the strain, in order to improve its performances and increase its tolerance to butanol in a chemically defined medium supplemented with YE and NO3-, and then iv) performing an evolutionary adaptation of the Butanol strain to allow its growth in the chemically defined medium without any supplementation. These strategies lead to i) the construction of a new E. coli strain, with its anaerobic growth depending on the functionality of an FNOR: the FNOR from C. acetobutylicum, the Rnf complex from C. ljungdahlii and the FNOR from C. tepidum were assessed. This work lead to the selection of a mutant of the FNOR from C. tepidum, which has a ferredoxin NAD+ reductase activity 2,2 times higher than the native enzyme. This mutant FNOR was then expressed in the E. coli strain producing butanol, as a replacement of C. acetobutylicum’s. The characterization of its phenotype demonstrated its capacity to produce 3 g/L of butanol, with a yield of 0,26 g/g; ii) the deletion of the genes zwf and mdh in the Butanol strain also lead to an improvement of the production in butanol up to 6 g/L , and of the yield up to 0,33 g/g; iii) the in-vivo evolution of the Butanol strain, in continuous culture (chemostat) with regulated pH, in the medium supplemented with YE and Ni, lead to the selection of an evolved strain producing up to 11 g/L of butanol, and a yield of 0,34 g/g. The complete sequencing of the genomes of the clones isolated from this population lead to the identification of mutations in two genes, yqhC and lptG, potentially involved in the strain’s performances; iv) the in-vivo adaptation of the Butanol strain in the medium without any supplementation lead to the selection of a evolved clones producing 2,5 g/L of butanol, and a yield of 0,28 g/g in batch culture. To our knowledge, the highest production of butanol observed coupled with anaerobic growth in E. coli does not exceed 0,6g/L, in a chemically defined medium base on glucose without any supplementation.; Dans le cadre du développement durable, la production de n-butanol par voie biologique est une alternative écologique par rapport à sa synthèse par voie pétrochimique. Il existe des microorganismes naturellement capables de produire du butanol, tels que les Clostridiae, bactéries Gram positif, ayant une croissance strictement anaérobie. Ils produisent du butanol au travers d’une fermentation produisant un mélange d’acétone, de butanol et d’éthanol. La production de butanol en mélange avec d’autres molécules diminue le rendement de production en butanol et augmente le coût de purification. En 2015, l’équipe PEEP de TBI a construit une souche d’E. coli génétiquement modifiée exprimant la voie complète de conversion du pyruvate en n-butanol de C. acetobutylicum. Le métabolisme de cette souche a été conçu pour que les vitesses de croissance et de consommation du glucose soient couplées à la vitesse de production du butanol. En croissance en anaérobiose stricte en culture discontinue dans un milieu chimiquement défini à base de glucose supplémenté en extrait de levure (YE) et nitrate (NO3-), cette souche produit 3,3 g/L de butanol à un rendement de 0,23 g butanol /g glucose, en présence de coproduits minoritaires (succinate, lactate, acétate, butyrate). Ces coproduits diminuent le rendement de production en butanol et restent inattendus car les voies métaboliques correspondantes ont été supprimées. L’objectif de ce projet de thèse est d’identifier les voies métaboliques impliquées dans la production de ces coproduits et d’améliorer la compréhension du métabolisme de cette souche, afin de l’optimiser, d’augmenter le rendement butanol/glucose, et de simplifier le milieu de culture. Plusieurs pistes ont été envisagées : i) Expression de ferrédoxines NAD(P)+ oxydoréductases (FNOR) issues d’organismes autres que C. acetobutylicum dans l’objectif de coupler l’étape de réoxydation de la ferrédoxine réduite à la production d’ATP ; ii) Inactivation des voies métaboliques d’E. coli susceptibles d’être impliquées dans la synthèse des coproduits ; iii) Evolution adaptative in vivo de la souche, afin d’améliorer ses performances et accroitre sa tolérance au butanol dans le milieu supplémenté avec YE et NO3-, puis iv) Evolution adaptative in vivo de la souche dans le milieu sans supplémentation. Ces stratégies ont conduit à i) La construction d’une nouvelle souche d’E. coli dont la croissance anaérobie dépend de la fonctionnalité d’une FNOR : la FNOR de C. acetobutylicum, le complexe Rnf de C. ljungdahlii et la FNOR de C. tepidum ont été évaluées. Cette approche a conduit à la sélection d’un mutant de la FNOR de C. tepidum, ayant une activité ferrédoxine NAD+ réductase 2,2 fois supérieure à celle de l’enzyme native. Cette FNOR mutante a ensuite été exprimée dans la souche d’E. coli Butanol en remplacement de la FNOR de C. acetobutylicum. La caractérisation de son phénotype a montré sa capacité à produire 3 g/L de butanol à un rendement de 0,26 g/g ; ii) La délétion des gènes zwf et mdh dans la souche Butanol a permis d’augmenter le titre en butanol produit à 6 g/L et le rendement à 0,33 g/g ; iii) L’évolution adaptative in-vivo de la souche d’E. coli Butanol en culture continue, dans le milieu supplémenté avec YE et Ni, a conduit à la sélection d’une population évoluée produisant 11 g/L de butanol à un rendement de 0,34 g/g. Le séquençage complet des génomes de clones isolés à partir de cette population a conduit à l’identification de mutations dans deux gènes, yqhC et lptG, potentiellement impliquées dans les performances de la souche ; iv) L’évolution adaptative in-vivo de la souche Butanol dans le milieu sans supplémentation a conduit à la sélection de clones évolués produisant 2,5 g/L de butanol à un rendement de 0,28 g/g en culture discontinue. A notre connaissance, la production maximale de butanol reportée, couplée à la croissance anaérobie chez E. coli, ne dépasse pas 0,6 g/L, en milieu chimiquement défini à base uniquement de glucose.