In fish, growth is regulated by a balance of inhibitory somatostatin (SST) and stimulatory pituitary adenylate cyclase activating peptide signals (PACAP). The inhibitory effect of SST reflects its capacity to block growth hormone (GH) secretion from the pituitary and in peripheral tissues via inhibition of GH stimulated pathways. The adipose tissue is the major energy store in the organism and is one of the main targets of this inhibition as fish growth is greatly dependent on the remobilization of stored lipids as a source of energy. These energy stores are tightly regulated by pancreatic hormones. In periods of accelerated growth, GH-stimulated pancreatic release of insulin (INS) and glucagon (GCG) promotes the remobilization of fats through the release of fatty-acids (lipolysis), while the inhibition of lipolysis is promoted by SST via inhibition of INS release. Thus, SST regulates growth both at the neuroendocrine level and at the metabolic level. We hypothesized SST as a candidate regulator of the energy trade-off between the high demanding energetic physiological processes of growth and reproduction. In fish, there is a marked relationship between body growth/weight and pubertal activation. For example, in zebrafish, pubertal development only proceeds when a critical length and weight (1.8 cm and 100 mg, respectively) is reached. As pubertal onset approaches, the growth rate decreases since gametogenesis requires not only extensive morphological changes but also the uptake of lipids (cholesterol, fatty acids) to sustain steroid production and build gamete reserves. However, the mechanism that regulates this shift in energy to support gametogenesis is still not known. While mammals have one SST gene, fish have four orthologue genes ( sst1, sst3 , sst4 and sst5 ) and two SST-like/cortistatin orthologues ( sst2 and sst6 ). In zebrafish, sst1 expression in the pituitary prior and after pubertal development suggest a possible role in reproductive function. In this species, the activation of pituitary cells during embryonic development (18-20 hpf) occurs in parallel with that of pancreatic cells ( ins , sst4 and gcg are detectable at 15-21 hpf), suggesting the synchronization of the key systems for growth and metabolism. To test if SST mediates the trade-off between growth/metabolism and reproduction in fish, we established CRISPR-cas9 mutant lines targeting the four sst orthologues in zebrafish. Mutation of sst4 , a gene involved in early pancreatic cell differentiation and the main SST produced in pancreas, resulted in fish that were significantly larger than the wild type at pubertal onset. However, gonadal maturation still proceeded with a slight delay in males. A sst3 -mutant line also had decreased growth until puberty and, interestingly, females were 50% more fecund and had higher breeding frequency (number of clutches produced) than their wild type counterparts. Analysis of early embryonic development and the migration of primordial germ cell (PGCs) labelled with GFP- nanos-3 showed that the embryos of mutants had a significantly higher number of PGCs, explaining the hyper-fecundity phenotype of adult females. Interestingly, these fish also produce significantly higher levels of ins and have significantly less adipose tissue due to the stimulation of lipolysis gene pathways. Thus, the female sst3 of mutant phenotype shows sst3 regulation of PGC proliferation in embryos and adults, and regulation of the ins-mediated pro-lipolysis actions in the adipose, without compromising growth. These results demonstrate that SST signalling regulates fecundity and metabolism in zebrafish and likely fish in general and other vertebrates. It also suggests that targeting sst3 during early development may be an invaluable tool to improve reproductive performance in aquaculture. Thus, in this project we propose to determine the specific timing and molecular mechanisms underlying the anti-proliferative effect of sst3 on PGCs and the regulation of the differentiation of ins -expressing cells in zebrafish (Tasks 1 and2) and use this knowledge to test if the manipulation of sst3 in sturgeons may be used as a tool to enhance the fecundity and metabolic performance of aquaculture breeders (Task 3). We chose sturgeons as the roe is a main product and the aquaculture industry struggles with the lower fertility of domesticated female breeders due to the excessive abdominal and periovarian fat deposition because of the high-fat feeds that are used to accelerate growth and advance the reproductive age. This excessive fat leads to decreased egg production, lower egg quality and lower survival at hatching. Thus, we intend to manipulate sst3 levels at early embryonic development to modulate the lipid metabolism and increase the number and quality of eggs produced by domesticated female breeders in aquaculture systems. Em peixes, a regulação do crescimento resulta do equilíbrio entre a inibição da somatostatina (SST) e a estimulação do péptido ativador da adenilato ciclase da pituitária (Pacap). A inibição da SST reflete a sua capacidade de bloquear a secreção da hormona de crescimento (GH) pela pituitária, mas também nos tecidos periféricos via inibição de processos estimulados pela GH. O tecido adiposo, a principal reserva de energia do organismo é o alvo principal dessa inibição, uma vez que o crescimento depende da utilização dos lípidos armazenados como fonte de produção de energia. Este processo é altamente regulado pelas hormonas pancreáticas insulina (INS), glucagon (GCG) e SST. Em períodos de crescimento acelerado, a libertação de INS e GCG estimulada pela GH promove a conversão de lípidos em ácidos gordos (lipólise), enquanto que a sua inibição é promovida pela SST via inibição da libertação de INS. Assim, a SST regula o crescimento tanto ao nível neuroendócrino como ao nível metabólico. Considerando estes efeitos metabólicos antagónicos, colocámos a hipótese de que a SST possa ter um papel regulador do balanço de energia entre processos fisiológicos energéticos altamente exigentes, como sejam o crescimento e a reprodução. Em peixes, existe uma relação marcada entre o crescimento/peso corporal e a ativação da puberdade. Por exemplo, no peixe-zebra a puberdade só ocorre quando um comprimento e peso críticos (1,8 cm e 100 mg, respetivamente) são alcançados. À medida que a puberdade se aproxima, o crescimento dos peixes diminui, uma vez que o desenvolvimento da gónada requer energia, alterações morfológicas extensas, assim como a absorção de lípidos (colesterol) para sustentar a produção de esteróides. No entanto, o mecanismo que regula este processo ainda não é conhecido. Enquanto os mamíferos só têm uma SST, os peixes têm quatro genes ortólogos ( sst1 , sst3 , sst4 e sst5 ) e dois ortólogos de cortistatina ( sst2 e sst6 ). No peixe-zebra, a expressão de sst1 na pituitária antes e depois da puberdade sugere um possível papel na função reprodutiva. De facto, nesta espécie, a ativação das células da pituitária durante o desenvolvimento embrionário (18-20 hpf) ocorre em paralelo com a das células pancreáticas ( ins , sst4 e gcg são detectados ??a 15-21 hpf), sugerindo a sincronização dos sistemas chave da reprodução e do crescimento/metabolismo. Para testarmos se a SST medeia este balanço energético, estabelecemos linhas mutantes CRISPR/cas9 visando as quatro sst ortólogas no peixe-zebra. A mutação da sst4 , um gene envolvido na diferenciação celular pancreática e principal SST produzida no pâncreas, resultou em peixes significativamente maiores do que os de tipo selvagem até ao início da puberdade. No entanto, a maturação da gónada não foi muito afetada e apenas se deteta um ligeiro atraso na gametogénese dos machos. Caracterizando a linha mutante para a sst3 verificámos que o crescimento também é maior nos mutantes até à puberdade e as fêmeas produziram mais ovos e tinham maior frequência de acasalamentos. A análise das células germinativas primordiais (PGCs) marcadas com GFP- nanos-3 nestes mutantes mostrou que têm um número significativamente maior, explicando o fenótipo de hiper-fecundidade das fêmeas adultas. Curiosamente, esses peixes também têm sobre-expressão de INS e têm menos tecido adiposo com estimulação dos genes reguladores de lipólise. Assim, o fenótipo dos mutantes sst3 mostra que nas fêmeas, a sst3 regula a proliferação de PGCs e regula as ações pró-lipolíticas da INS no tecido adiposo. Estes resultados mostram que a sinalização de SST regula a função reprodutiva e o metabolismo e destaca que a manipulação dos níveis de sst3 no início do desenvolvimento embrionário pode ser uma ferramenta inestimável para o melhoramento do desempenho reprodutivo de peixes em sistemas de aquacultura. Assim, neste projeto, propomos esclarecer a janela temporal específica e os sistemas moleculares subjacentes ao efeito anti-proliferativo da sst3 nas PGCs e regulação das células pancreáticas no peixe-zebra (Tarefa 1-2) e usar esse conhecimento para testar se a manipulação de sst3 em esturjões também pode ser uma ferramenta para aumentar a fertilidade e o desempenho metabólico dos reprodutores de sistemas de aquacultura (Tarefa 3). Escolhemos o esturjão já que o principal objectivo é obter ovas e a indústria debate-se com a redução da fertilidade das fêmeas em cativeiro devido à deposição excessiva de gordura na cavidade abdominal e no peri-ovário, em consequência das rações de elevado teor de gordura que são usados ??para acelerar o crescimento e antecipar a idade reprodutiva. A gordura excessiva leva à diminuição da produção e qualidade dos ovos, e menores taxas de sobrevivência após a eclosão. Assim, pretendemos manipular os níveis de sst3 no início do desenvolvimento embrionário para modular o metabolismo lipídico e aumentar o número e a qualidade dos ovos produzidos por fêmeas de esturjão em sistemas de aquacultura.

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