Osteosarcoma is the most common bone cancer. Despite the advance brought by chemotherapy, the therapy of recurrent, metastatic osteosarcoma hasn?t seen significant advances for decades. With this problem in view, the project?s primordial project goal is to test and develop new agents against osteosarcoma to be administered with the classical therapeutic agents. In the past, it has been observed that fisetin, a flavonoid with bone protective properties, significantly inhibited osteosarcoma cell proliferation in vitro. The project?s premise is therefore that fisetin derivatives (FDs) could represent interesting candidates against tumor progression, invasiveness and metastasis in osteosarcoma. For this, the UA (University of Aveiro) partners will be committed to design, synthesize, and characterize novel fisetin derivatives suitable for high-throughput screening of anti-proliferative and antimigratory effects in osteosarcoma 2D cultures, as performed by the REQUIMTE (Network for Chemistry and Technology) group. In a first stage, purchased FDs will be screened by the REQUIMTE group to prevent the delayed identification of bioactive compounds. In parallel, the 3D culture methods already implemented for one cell line will be optimized for two cell lines - HOS (non-invasive, weakly metastatic) and daughter cell line 143B (highly invasive and metastatic). The use of spheroids (in vitro microtumors) by the REQUIMTE group will guarantee that all assays will yield results more similar to an in vivo situation compared to 2D format. In addition, to increase the impact of findings, four FDs will be selected and the effects will be investigated also in mixtures with low-dose doxorubicin, the classical drug against osteosarcoma. Cellular processes and parameters related to metastasis will be studied in osteosarcoma spheroids in vitro in the presence of FDs, viz. cell cycle progression, apoptosis induction, COX-2 activity and expression under inflammatory-like conditions, cell motility and invasion. These activities will run in parallel to ensure the rapid identification of the candidate most suitable for in vivo testing. From the evaluation of FD effects, one FD will be chosen for application in a spontaneous metastasis model in immunocompromised mice. The in vivo model will recapitulate all aspects of osteosarcoma development and is expected to generate high-impact, useful information concerning the inhibition of tumorigenesis and metastasis formation by the chosen FD. O osteossarcoma é o cancro ósseo mais comum. Apesar dos avanços proporcionados pela quimioterapia, a terapia do osteossarcoma recorrente e metastático não vislumbra progressos significativos há décadas. Considerando o problema, o objetivo principal do projeto consiste em testar e desenvolver novos agentes contra o osteossarcoma, a ser administrados em conjunto com agentes quimioterápicos convencionais. Anteriormente, observou-se que a fisetina, um flavonóide protetor ósseo, inibira significativamente a proliferação de células de osteossarcoma in vitro. Consequentemente, a premissa do projeto é a de que os derivados da fisetina (Fisetin derivatives: FDs) podem ser candidatos de interesse contra a progressão tumoral, a invasividade e a metastização no osteossarcoma. Por conseguinte, os parceiros da UA (Universidade de Aveiro) empenhar-se-ão no desenho, síntese e caracterização de novos FDs adequados para triagem de elevada capacidade de efeitos anti-proliferativos e anti-migratórios em culturas em 2D de osteossarcoma, levada a cabo pelo grupo REQUIMTE (Rede de Química e Tecnologia). Numa fase inicial, os FDs comprados serão triados pelo grupo REQUIMTE por forma a prevenir a identificação tardia de compostos bioativos. Paralelamente, as culturas em 3D estabelecidas para outras linhas serão otimizadas para a linha celular HOS (não invasiva, fracamente metastática) e para a linha celular filha 143B (altamente invasiva e metastática). O uso de esferoides (microtumores in vitro) pelo grupo REQUIMTE garantirá que todos os ensaios produzirão resultados mais próximos de um cenário in vivo, quando comparados a um formato em 2D. Com vista a aumentar o impacto das descobertas, quatro FDs serão selecionados e os seus efeitos investigados também em mistura com dose baixa de doxorrubicina, o quimioterápico clássico contra o osteossarcoma. Processos celulares e parâmetros relacionados com a metástase serão estudados em esferoides de osteossarcoma in vitro, na presença de FDs, ex: progressão do ciclo celular, indução de apoptose, atividade e expressão de COX-2 sob condições simuladoras de inflamação, migração e invasão celular. Estas atividades decorrerão em paralelo para assegurar a rápida identificação do candidato mais adequado para teste in vivo. A partir da avaliação dos efeitos dos FDs, será escolhido um deles para aplicação em modelo de metástase espontânea em ratinhos imunocomprometidos. O modelo in vivo recapitulará todos os aspetos do desenvolvimento do osteossarcoma e prevê-se que origine informação útil de alto impacto relativamente à inibição de tumorigénese e da formação de metástases pelo FD selecionado.