Este procedimiento permitió evaluar la actividad biológica a 30 ºC de los supresores de silenciamiento HCPro y la proteína 2b. Estos supresores se expresaron bajo el control de promotores eucariotas, o como parte de amplicones virales agroinfiltrados (construcciones de PVX). Los resultados obtenidos demostraron que ambas proteínas eran capaces de suprimir el silenciamiento de un gen reportero de forma tan efectiva a 30 °C como a 25 ºC. En los ensayos de expresión mediante vectores basados en PVX ni la expresión de HCPro ni la de la proteína 2b favorecieron la acumulación viral, a pesar de haberse demostrado su efectividad como supresores a 30 ºC. También se empleó la agroinfiltración para comprobar si un ambiente enriquecido en CO2 alteraba la actividad supresora de HCPro o de la proteína 2b. Los resultados demostraron que ambos factores virales eran tan efectivos en la supresión del silenciamiento sobre un gen reportero en condiciones de elevado CO2 como en las condiciones normales. De igual modo a lo observado a elevada temperatura, la expresión de los mencionados supresores de silenciamiento mediante vectores basados en PVX tampoco favoreció la acumulación viral en condiciones de alto CO2. De todo esto se infiere que ninguno de los factores ambientales estudiados es capaz de afectar negativamente a la eficiencia de dichos supresores para neutralizar el silenciamiento antiviral bajo dichas condiciones, al menos por separado. Por ello, los efectos observados tanto en la infección por PVY como por las construcciones de PVX parecen no estar relacionados con el silenciamiento génico antiviral o con su supresión por factores virales. Para avanzar en el estudio del supresor de silenciamiento viral HCPro de PVY se siguieron dos aproximaciones: una de estudio de su localización y dinámicas subcelulares; y otra de caracterización de los RNAs que pudieran estar unidos a la misma in vivo en el curso de una infección. Para estudiar las dinámicas subcelulares de HCPro in vivo mediante microscopía confocal, éste se expresó en células epidérmicas de N. benthamiana fusionado a distintos marcadores para emitir fluorescencia, bien en su forma monomérica o como homodímero. En paralelo se caracterizaron las actividades funcionales de las proteínas de fusión para determinar si los marcajes afectaban a las funciones de HCPro. La microscopía confocal reveló una diversidad de patrones de distribución subcelular que incluyen una distribución difusa de HCPro por todo el citoplasma, o la presencia de inclusiones irregulares que contenían, al menos algunas de ellas α-tubulina, y cuyo tamaño y número pueden estar condicionados por factores externos. Además se descubrió un patrón de estructuras de tamaño y distribución regulares asociadas tanto al retículo endoplásmico como a los microtúbulos (MTs).

At 30 °C the accumulation of PVY and those of the three PVX constructs roughly halved. The severity of symptoms was also much reduced in infections by PVY and symptoms were even absent in plants infected with any of the PVX-derived constructs. By contrast, neither viral accumulation nor its associated symptoms were affected by the elevated temperature in CMV infections. Under elevated CO2 conditions no changes were observed in the intensity of infection symptoms or in their timing of appearance, for any of the viruses studied. However, under those same circumstances the accumulation of PVY and also those of the three PVX constructs was slightly reduced in leaf discs, but it increased with regard to the total protein content contained in those leaf discs. This was so because N. benthamiana plants grown under elevated CO2 conditions grew larger in size than plants grown under normal conditions, but the former contained approximately half the total protein content than the latter in equivalent leaf discs. On the other hand, the accumulation of CMV at elevated CO2 levels increased in both, equivalent leaf discs, and even further with regard to total protein content. Thus, the five viruses analyzed could be clustered into two separate groups based on in their response to elevated temperature or ambient CO2 levels: PVY and the three PVX constructs on the one hand, CMV on the other. The agroinfiltration technique has been widely used to transiently express in plants nucleic acids and the protein products that they may encode. The technique allows the study and quantification of some of the biological properties of those proteins, such as for example the suppressor of antiviral silencing activities of certain viral factors. However, one drawback of the technique is that at temperatures above 29 °C the transfer of genetic information from the bacteria to plant cells is prevented. As one of the objectives of this research was to study the biological activities of the viral silencing suppressors HCPro and the 2b protein at the temperature of 30 °C, a procedure had to be envisaged to allow its use at this non-permissive temperature. It was reasoned that if a time window at 25 °C was allowed after infiltration, some transfer of information from the bacteria to the plant cell would take place, and afterwards when increasing temperature to 30 °C the proteins expressed would accumulate and perform their functions at that temperature. A window time of just 12 hours before placing the plants at 30 °C gave unsatisfactory results, but a 24 hour window at 25 °C allowed the accumulation of several proteins, including a fluorescent protein reporter, comparable to those observed in assays performed all the time at 25 °C.

En condiciones de elevado CO2 no se observaron cambios en la intensidad o en el momento de la aparición de los síntomas derivados de las infecciones virales estudiadas. Sin embargo, bajo estas circunstancias ambientales la acumulación de PVY así como las de las construcciones de PVX se vieron ligeramente disminuidas en discos foliares, pero se incrementaron al relativizarlas a las proteínas totales contenidas en los discos foliares. Esto fue así porque las plantas de N. benthamiana crecidas bajo condiciones de elevados niveles de CO2 ambiental alcanzaron mayor tamaño que el de las plantas crecidas en condiciones normales, pero con una cantidad de proteína total en discos de tejido foliar que fue aproximadamente la mitad que la encontrada en discos equivalentes de plantas crecidas en condiciones normales. Por otra parte, la acumulación de CMV aumentó en un ambiente de alto CO2 en discos foliares equivalentes, e incluso más relativizándola a proteínas totales. Los virus analizados se pudieron pues separar en dos grupos según su respuesta, tanto a la elevada temperatura como al elevado CO2 ambiental: PVY y los vectores de PVX por un lado, CMV por el otro. La técnica de la agroinfiltración ha sido ampliamente utilizada para expresar transitoriamente ácidos nucleicos y las proteínas que puedan codificar en plantas. La técnica permite estudiar y cuantificar algunas actividades biológicas, como por ejemplo la supresión del silenciamiento antiviral por ciertas proteínas virales. Sin embargo, un inconveniente de la agroinfiltración es que temperaturas superiores a 29 ºC impiden la transferencia de información genética desde la bacteria a las células vegetales. Dado que uno de los objetivos de este trabajo era el estudio de la actividad de los supresores de silenciamiento virales HCPro y proteína 2b a la temperatura de 30 ºC, se tuvo que diseñar un procedimiento que permitiera su uso. Se razonó que si se permitía una ventana temporal a 25 °C después de la agroinfiltración, la transferencia de información de la bacteria a la planta tendría lugar, y al elevar la temperatura a 30 °C las proteínas expresadas se acumularían y realizarían su función a dicha temperatura. No se obtuvieron resultados satisfactorios dando un lapso de 12 horas a 25 ºC previo al emplazamiento de las plantas a 30 ºC. Sin embargo, un lapso de 24 horas a 25 ºC después de la agroinfiltración permitió la acumulación de varias proteínas, incluyendo la de un marcador fluorescente, comparable a las observadas en ensayos realizados a 25ºC.

This procedure allowed the evaluation of the biological activities of the viral suppressors HCPro and 2b protein. Those suppressors were expressed either under the controls of eukaryotic promoters, or as part of agroinfiltrated viral amplicons (PVX constructs). The results obtained showed that both proteins were capable of suppressing the silencing of a reporter gene as effectively at 30 °C as at 25 °C. The expression assays from PVX-based constructs showed that neither HCPro nor the 2b protein helped the virus construct to accumulate further at 30°C, in spite of both proteins being affective suppressors at that temperature. Agroinfiltration was also employed to test whether an enriched CO2 environment altered the suppressor activities of HCPro and of the 2b protein. Results showed that both viral factors were as effective in silencing suppression of a reporter gene at elevated CO2 levels as in normal conditions. Similarly to what was found at elevated temperature, expression of either suppressor from PVX vectors failed to favor viral accumulation at elevated CO2 levels. From all this it can be concluded that neither of the two environmental parameters separately had a negative effect on the effectiveness of thesethe effects on infection by PVY or by the three PVX constructs seem to be unrelated to antiviral gene silencing or its suppression by viral factors. To study further the viral suppressor of silencing HCPro from PVY two approaches were followed: one that studied its subcellular localization and dynamics in vivo; and another one that characterized the RNAs that could be bound to this protein also in vivo during the course of infection. To study HCPro subcellular dynamics in vivo by confocal microscopy, the protein was expressed in N. benthamiana epidermal cells fused to different tags, in order to emit fluorescence either as a monomer, or as a homodimer. In parallel to this, the functional activities of these fusion proteins were characterized, to determine how these tags affected HCPro biological functions. Confocal microscopy observations revealed a diversity of subcellular distribution patterns that included HCPro diffuse distribution throughout the cell cytoplasm, or its presence in irregular inclusions that also contained, at least some of them, α-tubulin, and whose size and number could be influenced by external factors. In addition, a pattern of structures of regular size and distribution was discovered, associated to the endoplasmic reticulum, as well as to microtubules (MTs).

La exposición de las células a ciertos estreses originó que HCPro se translocara desde estas estructuras regulares (y quizás también desde otras partes del citoplasma) hacia el citoesqueleto de MTs, hasta cubrirlo completamente. No se observó que HCPro se localizase asociado con los filamentos de actina o con el aparato de Golgi. A pesar de esta asociación con los MTs, la integridad de este citoesqueleto celular no es requerida para que HCPro medie la transmisión de PVY por su insecto vector Myzus persicae, ni tampoco para su supresión del silenciamiento de un gen reportero en ensayos agroinfiltración. La razón funcional de estos patrones y dinámicas subcelulares de HCPro permanece pues por aclarar. Para caracterizar si HCPro une RNAs in vivo y la naturaleza de dichos RNAs se purificó esta proteína marcada con una cola de seis histidinas a partir de tejido de plantas infectadas por un vector viral basado en PVX, que la expresaba. La purificación se realizó en condiciones no desnaturalizantes mediante una resina de agarosa cargada de níquel, y como control el mismo proceso se realizó con plantas infectadas con el vector viral PVX vacio. Los RNAs menores de 500 nucleótidos (nts) se extrajeron de ambas muestras, se procedió a la secuenciación masiva de los mismos. Mediante herramientas bioinformáticas se analizaron y compararon las secuencias obtenidas de ambas muestras. Los resultados muestran que HCPro une RNAs pequeños (sRNAs) de 21 y 22 nts, mostrando preferencia por aquellos de secuencia viral (vsRNAs) sobre los de secuencia de la planta, a pesar de ser estos últimos mucho más numerosos. También une en mucha menor medida algunos RNAs de tamaños mayores, también con secuencias virales. Además, se encontró que los vsRNAs de 21 y 22 nts unidos a HCPro estaban enriquecidos en secuencias que tenían una adenina en su extremo 5’, hecho que no se observó en los RNAs de otros tamaños de secuencia viral o en los sRNAs con secuencias de la planta. Estos resultados sugieren que una forma en la que HCPro podría realizar su función de supresor de silenciamiento sería mediante el secuestro de sRNAs específicos: de 21 y 22 nts, secuencia viral y con adeninas en sus extremos 5’, que de otro modo podrían incorporarse al efector antiviral Argonauta2.

Exposure of cells to some stresses caused HCPro to translocate from these regular structures (perhaps also from other parts of the cytoplasm) towards the MT cytoskeleton, coating it completely. No association of HCPro to actin filaments or to the Golgi was observed. In spite of its association with MTs, the integrity of this cellular cytoskeleton was found not to be required for HCPro-mediated transmission of PVY by its insect vector Myzus persicae, or for its suppression of the silencing of a reporter gene in agropatch assays. The functional reasons of these distribution patterns and their dynamics remain thus to be explained. To characterize whether HCPro would bind to RNAs in vivo, and the nature of those bound RNAs the protein tagged with six histidines was purified from leaf tissue of plants infected with a PVX-based vector that expressed it. The purification was performed under non-denaturing conditions using a nickel charged resin, and as control, the same procedure was followed using tissue from plants infected with the empty PVX vector. RNAs of less than 500 nucleotides (nts) were extracted from both samples and deep sequenced. The sequences obtained were analyzed and compared using bioinformatic tools. Results show that HCPro binds to small RNAs (sRNAs) of 21 and 22 nts in length, preferentially to those that have a virus-derived sequence (svRNAs) over those that are of plant sequence, in spite of the latter being much more abundant than the former. It also appears to bind to larger RNAs also of viral sequence, to a much lesser degree. In addition to this, the svRNAs of 21 and 22 nts bound to HCPro were found to be enriched in sequences that had adenines at their 5’-ends. This did not occur in bound RNAs of other sizes or of plant sequence. These results suggest that a way by which HCPro could perform its suppressor function could be through the sequestration of specific types of sRNAs: of 21 and 22 nts in length, of viral sequence and with 5’-end adenines, which could otherwise incorporate into the antiviral Argonaute2 effector.

[ES] La presente memoria de investigación presenta y discute los resultados de trabajos que estudian, por un lado, los efectos de dos factores ambientales, la temperatura y los niveles de CO2 en infecciones compatibles de plantas por virus de RNA de polaridad positiva, y también en el silenciamiento antiviral y en su supresión por factores virales. Y por otro lado estudia las propiedades del supresor de silenciamiento viral HCPro del Virus Y de la patata (Potato virus Y, PVY), mediante aproximaciones de biología celular y molecular. Para estudiar cómo incrementos en los valores de estos factores ambientales pueden afectar a las infecciones virales de plantas se estudió su efecto por separado en la infección de la planta Nicotiana benthamiana por varios de estos virus: el Virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV), PVY, y un vector de expresión derivado del Virus X de la patata (Potato virus X, PVX) vacio, o expresando los supresores de silenciamiento de PVY o de CMV, HCPro y la proteína 2b, respectivamente. En condiciones de elevada temperatura (30 ºC) o de elevados niveles de CO2 (970 partes por millón, ppm) se analizaron la acumulación viral sistémica, los síntomas de infección, y la actividad de los supresores de silenciamiento de estos virus, comparándolos con los obtenidos en las condiciones “normales” de 25 ºC y 401 ppm de CO2. A 30 ºC la acumulación de PVY y las de las tres construcciones de PVX se vieron disminuidas a aproximadamente la mitad. La severidad de los síntomas también se redujo mucho en la infección por PVY e incluso no hubo síntomas en las infecciones por los virus derivados de PVX. Por el contrario ni la acumulación viral ni los síntomas asociados se vieron afectados por la elevada temperatura en la infección por CMV.

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[EN] This Research Report presents and discusses results obtained in work that on the one hand studies effects that the environmental factors temperature and ambient CO2 levels cause on compatible infections of plants by positive-sense RNA viruses and also on the antiviral silencing defense and its suppression by viral factors. And on the other hand, studies the properties of the viral suppressor of silencing HCPro from Potato virus Y (PVY), using cell and molecular biology experimental approaches. To study how increases in the values of those two environmental factors could affect viral infections of plants we addressed each separately in infections of the host Nicotiana benthamiana by several viruses: Cucumber mosaic virus (CMV), PVY, and a viral expression vector derived from Potato virus X (PVX) either empty, or expressing the suppressors of silencing of PVY or CMV, HCPro and 2b protein, respectively. Systemic viral accumulation levels, infection symptoms, and the activities of the viral suppressors were analyzed under elevated temperature conditions (30 ºC) or under elevated ambient levels of CO2 (970 parts per million, ppm) and were compared to those found at the “normal” conditions of 25 ºC and 401 ppm levels of CO2.

Proyecto “Función de determinantes de patogenicidad viral en los balances que seestablecen en interacciones compatibles virus RNA-planta” del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) de España y proyecto (PJ00946102) de la Rural Development Administration de la República de Corea en cooperación con el CSIC